《食品科学》：武汉轻工大学宫智勇教授、许琳副教授等：迷迭香酸共价偶联对β-乳球蛋白结构及性质的影响

乳清蛋白是一种重要高营养优质蛋白，约占牛乳蛋白总量的20%。β-乳球蛋白（β-LG）是牛乳清蛋白的主要成分，约占乳清蛋白总量的50%，具有良好的乳化性、起泡性以及抗氧化等性能，因此作为功能性配料广泛应用于乳制品、烘焙食品以及功能饮料等食品中。然而，乳清蛋白性质不稳定。近年来，通过与多糖和多酚等天然活性分子偶联，改变乳清蛋白的结构和功能特性受到了学者们的广泛关注。

迷迭香酸（RA）是一种多酚类活性成分，广泛存在于紫苏、迷迭香和甜罗勒等可食用的草本植物中。本课题组最近的研究表明，RA通过其抗氧化和抗炎活性对卵清蛋白诱导的食物过敏肠道炎症反应有保护作用。

武汉轻工大学大宗粮油精深加工教育部重点实验室的杨庆、宫智勇*、许琳*等以牛乳清蛋白β-LG为对象，探究与RA共价偶联对其结构和性质的影响。选用自由基法和碱法制得β-LG-RA共价偶联复合物，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、荧光光谱、紫外光谱和傅里叶变换红外光谱（FTIR）等方法分析与RA共价偶联前后β-LG蛋白结构的变化；采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）阳离子自由基清除能力分析处理前后β-LG抗氧化活性的变化；最后，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）研究RA共价偶联对β-LG与血清特异性免疫球蛋白G（IgG）结合能力的影响。

01

共价偶联方法的建立

β -LG-RA共价偶联复合物制备过程中的颜色变化如图1所示。在0 h时，自由基法制备的样品呈现乳浊液状，碱法制备的样品呈透明淡黄色（图1A）；在8、16 h及24 h时，β-LG、RA及自由基法制备的样品无明显颜色变化，但碱法制备的样品颜色逐渐加深，最终呈现棕褐色（图1B～D）。SDS-PAGE结果显示，自由基法和碱法制得的β-LG-RA共价偶联复合物条带与β-LG相比，均显著向上迁移（图2A），表明RA成功地共价结合到β-LG分子上，并对蛋白的分子质量产生显著影响。这与Xue Yuting等报道的阿魏酸共价偶联降低β-LG免疫原的研究中SDS-PAGE结果一致。如图2B所示，自由基法和碱法制得的β-LG-RA复合物中RA的结合量分别为（40.04±0.69）mg/g和（45.10±0.50）mg/g。碱法制得的β-LG-RA复合物中RA的结合量显著高于自由基法制得的β-LG-RA复合物（P＜0.05）。通过这些发现推断自由基法和碱法均成功制备了β-LG-RA共价偶联复合物。

自由羰基的形成是蛋白质氧化的重要标志。如表1所示，β-LG、自由基法和碱法制得的β-LG-RA复合物游离羰基含量分别为（1.43±0.01）、（0.85±0.14）nmol/mg和（1.02±0.04）nmol/mg。与β-LG相比，β-LG-RA复合物游离羰基含量显著减少（P＜0.05）。RA具有较强的抗氧化活性，与β-LG共价结合可抑制蛋白质氧化，进而阻碍游离羰基的形成。蛋白质结构的变化会引起游离巯基含量的变化。与β-LG相比，自由基法制得的β-LGRA复合物游离巯基含量显著减少（P＜0.05）；碱法制得的β-LG-RA复合物游离巯基含量上升。结果表明，自由基法与碱法制得的β-LG-RA在结构变化上有显著差异。通常在蛋白二硫键断裂且游离巯基暴露于蛋白表面时，蛋白质的游离巯基含量会增加。自由基法和碱法制得的β-LG-RA中游离巯基含量呈不同变化趋势，这可能与不同制备方法对蛋白结构影响的差异密切相关。进一步，在游离酪氨酸含量的检测中观察到自由基法和碱法制得的β-LG-RA复合物游离酪氨酸含量均显著降低（P＜0.05）。与天然β-LG相比，β-LG-RA共价偶联复合物的游离基团含量均发生了显著变化，表明RA的共价偶联对蛋白质的结构产生了显著影响，从而改变了蛋白游离基团的暴露。通过分析游离羰基、游离巯基及游离酪氨酸含量的变化，进一步证明RA成功地与β-LG共价偶联。

02

RA共价偶联对β-LG蛋白结构的影响

2.1 FTIR光谱分析

FTIR被广泛应用于研究蛋白质结构变化规律。蛋白质的FTIR光谱中，酰胺I带（1 600～1 700 cm -1 ）主要反映C＝O伸缩振动；酰胺II带（1 500～1 600 cm -1 ）主要反映C—N伸缩振动和N—H变形振动；3 200～3 400 cm -1 处吸收峰主要反映O—H和N—H伸缩振动。如图3所示，自由基法和碱法制得

-LG-RA复合物的红外光谱与天然

-LG相比有显著差异。3 种样品在酰胺I带均出现了特征吸收峰，在3 200～3 400 cm -1 处也出现了O—H和N—H伸缩振动。天然

-LG酰胺I带的吸收峰在1 606.19 cm -1 处，而自由基法和碱法制得的

-LG-RA酰胺I带的吸收峰分别迁移至1 605.13 cm -1 和1 606.51 cm -1 ，酰胺I带的变化说明RA共价偶联对

-LG的二级结构产生了影响。特别是自由基法制得的样品向波数较小一侧移动，表明自由基法RA共价偶联使蛋白N—H和C＝O形成的氢键数量增加。自由基法和碱法制得的

-LG-RA在3 500～3 200 cm -1 （—OH）波数范围内均出现了宽峰，表明与

-LG相比，

-LG-RA复合物的氢键增强，这归因于RA的共价结合引入了更多的羟基。

2.2 内源荧光光谱分析

蛋白质含有的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸，在一定波长激发下可产生内源荧光，其荧光强度和波峰波长的变化可表征蛋白三级结构的变化，因此，荧光光谱被广泛应用于蛋白质结构的研究。如图4所示，天然β-LG内源荧光在337 nm附近有最大吸收峰，自由基法和碱法制得的β-LG-RA相比于天然β-LG其内源荧光强度降低，说明RA与β-LG的相互作用改变了β-LG构象，猝灭了蛋白的内源荧光，这与Xue Yuting等的研究结果相似。

2.3 紫外光谱分析

蛋白质中酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基的苯环含有共轭双键，这使蛋白质具有吸收紫外线的特性。蛋白分子的结构发生改变，紫外吸收光谱也会发生相应的变化。如图5所示，自由基法和碱法制得的β-LG-RA紫外吸收峰显著高于β-LG，RA的共价结合表现出增色效应。说明RA的共价结合使β-LG分子中酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸残基暴露，增强了其紫外吸强度。自由基法和碱法制得的β-LG-RA复合物最大吸收峰波长出现明显的红移，表明RA的共价偶联对蛋白中显色氨基酸的微环境产生显著影响。而且自由基法和碱法制得的β-LG-RA复合物在310～340 nm波长范围出现了新的峰，这可能由RA在偶联过程中发生氧化产生。

2.4 圆二色光谱分析

α-螺旋在222、208 nm附近呈负峰，在190 nm附近呈正峰；β-折叠在215 nm波长处呈负峰，在185～200 nm波长处呈正峰；其中峰强度与结构含量呈正相关。如图6所示，所有样品在约190 nm波长处均出现正峰，在210 nm附近出现负峰。利用DichroWeb软件对圆二色光谱数据分析，结果表明自由基法和碱法制得的β-LG-RA复合物二级结构中α-螺旋相对含量显著降低（天然β-LG：34.15%；自由基法β-LG-RA：20.87%；碱法β-LG-RA：20.63%）（P＜0.05），β-折叠相对含量显著上升（天然β-LG：18.64%；自由基法β-LG-RA：24.30%；碱法β-LG-RA：24.22%）（P＜0.05），无规卷曲相对含量也显著上升（天然β-LG：27.90%；自由基法β-LG-RA：35.67%；碱法β-LG-RA：35.68%）（P＜0.05），而β-转角相对含量无显著变化。

03

RA共价偶联对β-LG抗氧化能力的影响

通过检测DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率评价样品的抗氧化能力。如图7所示，与

-LG相比，RA共价偶联的

-LG DPPH自由基清除能力均显著提高。其中自由基法制得的

-LG-RA复合物DPPH自由基清除率可高达70.62%。ABTS阳离子自由基清除率检测结果与DPPH自由基清除率相似，RA共价结合可显著提高

-LG的ABTS阳离子自由基清除率。结果表明RA的共价结合可显著提高

-LG的抗氧化能力。蛋白-多酚偶联复合物中抗氧化活性与多酚含量密切相关，酚羟基的引入是复合物抗氧化活性增强的主要原因。RA是一种富含羟基的咖啡酸酯天然多酚类化合物，因此，与

-LG共价结合后，增加了蛋白羟基含量，进而提高了蛋白的抗氧化性。

04

RA共价结合对β-LG结合IgG能力的影响

竞争抑制率表示样品中的竞争抗原蛋白对人血清中抗体与致敏原的结合抑制作用。由图8可知，自由基法和碱法

-LG-RA共价偶联复合物与牛乳过敏患者血清IgG结合能力均显著下降（

P

＜0.05）。与天然

-LG相比，自由基法和碱法制得的

-LG-RA共价偶联复合物在0.1 μg/mL时与IgG的结合率分为5.51%和2.40%，在1 μg/mL时分别为26.94%和23.64%，在10 μg/mL时分别为57.85%和50.01%，在100 μg/mL时分别为72.63%和69.34%，均显著低于在相应质量浓度下

-LG的IgG结合率（

P

＜0.05）。其中，碱法制得的

-LG-RA抑制率下降程度更大。致敏蛋白结合抗原特异性IgG的能力与蛋白特定结构的折叠或展开密切相关。结合上述RA共价偶联对

-LG结构的影响，结果表明RA通过与

-LG氨基酸残基共价结合影响蛋白结构，从而降低了

-LG与牛乳特异性过敏患者血清IgG结合的能力。

结 论

与天然活性分子共价结合作为一种新型的加工方式，在改变蛋白质的结构与性质中表现出巨大的应用前景。RA是一种广泛分布于食源性草本植物中的咖啡酸酯类化合物，具有较强的抗氧化和免疫调节活性。本研究利用自由基法和碱法成功制得了β-LG-RA共价复合物。RA的引入显著提高了β-LG蛋白的抗氧化活性。FTIR、紫外光谱、荧光光谱以及圆二色光谱分析结果表明，RA与β-LG的共价结合对β-LG结构产生了显著影响。与RA共价结合后，β-LG中α-螺旋结构含量显著降低，β-折叠和无规卷曲含量显著增加。本研究深入分析了RA共价偶联后β-LG结构变化规律及性质，可为基于膳食活性分子共价偶联对β-LG的改性制备提供一定的理论依据。

《迷迭香酸共价偶联对β-乳球蛋白结构及性质的影响》来源于《食品科学》2024年45卷11期，作者：杨庆，尚洁丽，曾浩龙，王璇霈，陈义杰，柳鑫，宫智勇*，许琳*。DOI：10.7506/spkx1002-6630-20231101-001。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：普怡然；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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