《Bioactive Materials》清华大学王秀梅：各向异性结构的水凝胶用于加速糖尿病伤口愈合

摘要

由于多种类型的细胞功能障碍和多维微环境的损害，慢性糖尿病患者的伤口愈合仍然具有挑战性。结构各向异性的物理信号提供了通过物理接触和细胞机械力传感途径协调多细胞调节的重要潜力，而与细胞类型无关。在这项研究中，我们开发了一种高度定向的各向异性的水凝胶，旨在为细胞延伸和细胞骨架组织提供定向指导，从而实现明显的多细胞调节，包括巨噬细胞的形状诱导极化，许旺细胞的形态成熟，成纤维细胞定向细胞外基质（ECM）沉积，以及内皮细胞增强血管形成。此外，我们还引入了一种VEGF模拟肽，以进一步增强血管生成，这是一个与免疫调节、神经发生和组织再生互锁的关键阶段，最终有助于优化微环境间串扰。体内研究证实，各向异性生物活性水凝胶通过利用免疫-血管生成-神经生成微环境的三元协同作用有效地加速糖尿病伤口愈合。我们的研究结果突出了将物理和生物活性信号结合起来用于调节各种细胞类型和细化多维微环境的潜力，为糖尿病伤口愈合提供了一种新的策略。相关论文“Anisotropic structure of nanofiber hydrogel accelerates diabetic wound healing via triadic synergy of immune-angiogenic-neurogenic microenvironments”于2025年1月11日在线发表于杂志《Bioactive Materials》(IF=18.0)上。

背景简介

糖尿病是一种慢性代谢紊乱，影响全球超过十分之一的成年人，导致各种并发症和患者生活质量下降。糖尿病伤口是以破坏性微环境为特征的慢性和不愈合伤口，通常导致高医疗成本和截肢风险增加，从而对组织修复构成重大挑战。尽管有各种可用的治疗方法，包括手术清创、伤口卸载、负压伤口治疗、高压氧治疗、神经减压和基于抗菌的治疗，但糖尿病伤口愈合的临床结局仍不令人满意。伤口愈合过程由复杂和重叠的阶段组成，包括止血、炎症、增殖和重塑，这些阶段在糖尿病伤口中由于不平衡的微环境而被破坏，导致愈合时间延长。持续的高血糖和糖尿病伤口中缺氧微环境主要负责诱导严重的氧化应激、高感染风险、慢性炎症、受损的血管形成、神经病并发症和各种细胞功能障碍，从而构建延迟组织再生的抑制性微环境。糖尿病伤口的复杂路径病理学特征限制了单因素愈合策略的有效性，因为忽略了多种细胞功能障碍和多维微环境损害。因此，专注于通过生物活性材料调节多种细胞类型的治疗策略正在成为糖尿病伤口愈合的促进方法。

研究概况

在这项研究中，我们开发了生物活性各向异性纤维蛋白水凝胶，以提供定向结构和促血管生成信号的双重影响，通过免疫-血管生成-神经生成微环境优化的三元协同作用加速糖尿病伤口愈合。利用静电纺丝制备的各向异性的生物可降解水凝胶，表现出理想的纤维排列和显著的多细胞调节能力，诱导内皮细胞血管化，调节巨噬细胞表型转变，促进雪旺细胞成熟，并增强成纤维细胞外基质（ECM）沉积。此外，KLT肽的掺入增强了免疫、血管和神经微环境之间的串扰，揭示了体外多维微环境重建的潜力。随后，在大鼠糖尿病伤口愈合模型中评估生物活性对齐水凝胶的再生效率。组织学结果表明，炎症、血管和神经微环境的显著优化，重建了用于有组织ECM重塑、伤口闭合加速和皮肤组织再生的促再生小生境。本研究通过多维微环境优化，重点介绍了各向异性纤维水凝胶在糖尿病伤口愈合中的应用，为临床治疗慢性伤口愈合的先进策略提供了新的见解。

图1 AFGKLT水凝胶的制备与表征。A）用于AFGKLT制备的电纺丝和自组装肽缀合的示意图。B、C）RAD/KLT肽、纤维蛋白原和AFGKLT水凝胶1H NMR光谱（B）和FTIR光谱（C）。D、E）RFG、RFGKLT、AFG和AFGKLT水凝胶的代表性SEM（D）和TEM（E）图像。F）RAD/KLT肽在RFG和AFG水凝胶上的自组装结合率。G）RFGKLT和AFGKLT水凝胶在PBS中于37 ℃下培养24小时后的肽释放曲线。H）相应水凝胶的接触角。I）相应水凝胶的水含量。J）在1%的恒定应变下，在频率扫描（从0.1Hz到10 Hz）中相应水凝胶的储能（G′）和损耗（G″）模量的流变学测量。K）相应水凝胶在1Hz和1%应变下的平均储能模量和损耗模量。L）用储存和损耗模量计算的相应水凝胶的平均损耗因子（tan δ）。

图2 AFGKLT水凝胶诱导内皮细胞的形态分化和组织化。A）在24小时时不同组中HUVEC募集试验的代表性照片。B）在不同水凝胶上培养24小时的具有CD31（红色）和DAPI（蓝色）的HUVEC的代表性免疫染色图像。C）每个视野中招募的HUVEC数量的定量分析。D）在不同水凝胶上培养72小时的HUVEC的代表性SEM图像。E）在不同水凝胶上培养72小时的HUVEC的相对基因表达。F）在不同水凝胶上培养72小时的HUVECs的VEGF和PDGF的分泌。

图3 AFGKLT水凝胶调节巨噬细胞的抗炎极化。A）在不同的水凝胶和条件下培养24小时的具有iNOS（绿色）、CD 68（红色）和DAPI（蓝色）的RAW 264.7巨噬细胞的代表性免疫染色图像。B）在不同水凝胶和条件下培养24小时的具有CD 206（绿色）、CD 68（红色）和DAPI（蓝色）的RAW 264.7巨噬细胞的代表性免疫染色图像。C、D）iNOS阳性（C）和CD 206阳性（D）细胞相对于CD 68阳性细胞的百分比的定量分析。E、F）在不同水凝胶和条件下培养24小时的RAW 264.7巨噬细胞的IL-6（E）和IL-10（F）的分泌。G、H）在不同水凝胶和条件下培养24小时的RAW 264.7巨噬细胞的相对促炎（G）和抗炎（H）基因表达。

图4 AFGKLT水凝胶可促进雪旺细胞成熟。A）在不同水凝胶上培养72小时的RSC-96与S100（绿色）、p75（红色）和DAPI（蓝色）的代表性免疫染色图像。B、C）在不同水凝胶上培养72小时的成熟（B）和分泌（C）相关基因的相对基因表达。D）在不同的水凝胶上培养72小时的RSC-96的BDNF、NGF和CNTF的神经营养蛋白分泌。

图5 AFGKLT水凝胶促进成纤维细胞ECM重塑能力。A）在0小时和24小时，不同组中的L929成纤维细胞的划痕愈合试验的代表性照片。B）在不同水凝胶上培养72小时的L929成纤维细胞的代表性细胞骨架染色图像，通过鬼笔环肽（红色）和DAPI（蓝色）染色而可视化。C）在24小时时划痕伤口闭合的定量分析。D）在不同水凝胶上培养72小时的L929成纤维细胞细胞骨架分支长度的定量分析。E）在不同水凝胶上培养72小时的L929成纤维细胞的相对基因表达。

图6 AFGKLT水凝胶可调节微环境间串扰。A）在RAW 264.7的血清中培养的HUVEC、RSC-96和L929的示意图，所述RAW 264.7的血清在不同水凝胶上培养（A1）。72小时时HUVEC或RSC-96的相对基因表达（A2、A4）和细胞骨架染色图像（A3、A5），24小时时L929与RAW 264.7间接共培养的募集试验的定量分析（A6）和代表性照片（A7）。B）RSC-96和L929在不同水凝胶上培养的HUVEC的血清中培养的示意图（B1）。RSC-96的相对基因表达（B2）和细胞骨架染色图像（B3）、增殖CCK-8测定中的定量分析（B4）以及与HUVEC间接共培养72小时的L929的代表性亮视野照片（B5）。C）在不同水凝胶上培养的RSC-96的血清中培养的HUVEC和L929的示意图（C1）。HUVEC的相对基因表达（C2）和细胞骨架染色图像（C3），与HUVEC间接共培养72 h的L929的相对基因表达（C4）和α-SMA免疫染色图像（C5）。D）免疫-血管生成-神经原性微环境之间三元相互作用的一般说明。

图7 AFGKLT水凝胶可加速糖尿病伤口愈合和基质重建。A）动物实验和组织采集时间轴示意图。B）在手术后第0天、第7天、第14天、第21天和第28天，不同处理组中的糖尿病伤口的代表性照片。C）不同治疗组伤口愈合过程示意图。D）在术后第7天、第14天、第21天和第28天，对不同治疗组中的伤口面积进行定量分析。E）术后第7天和第28天，不同治疗组的代表性H&E染色图像;虚线表示病变部位的边界。F、G）术后第28天，根据H&E染色图像，对不同治疗组的上皮厚度（F）和伤口宽度（G）进行定量分析。H）术后第28天不同治疗组的Masson染色的代表性图像;虚线表示病变部位的边界。I）在手术后第28天，不同处理组的用K14（红色）和DAPI（蓝色）的代表性免疫荧光染色。I）来自Masson染色的胶原沉积百分比的定量分析J）来自K14免疫染色的真皮附件的平均数目的定量分析。

图8 AFGKLT水凝胶可调节免疫-血管生成-神经生成微环境的三元协同作用。A）术后第7天和第14天，不同处理组中的组织切片的代表性免疫染色图像，CD 86（红色）、CD 206（绿色）和DAPI（蓝色）。B-D）术后第28天不同处理组组织切片的代表性免疫染色图像，（B）S100（红色）、CD 31（绿色）和DAPI（蓝色）;（C）CD 31（红色）、α-SMA（绿色）和DAPI（蓝色）;（D）SOX 10（红色）、α-SMA（绿色）和DAPI（蓝色）。E，F）CD 86-CD 206共染色图像中CD 86阳性细胞（E）和CD 206阳性细胞（F）的定量分析。G，H）来自CD 31-S100共染色图像的CD 31阳性（G）和S100阳性（H）面积百分比的定量分析。I）来自CD 31-α-SMA共染色图像的微血管数量的定量分析。J）来自SOX 10 α-SMA共染色图像的神经嵴数量的定量分析。K）伤口愈合图和潜在机制的示意图。

总结与讨论

综上所述，我们成功地通过纤维蛋白静电纺丝和自组装肽修饰制备了具有生物活性的各向异性水凝胶。这种水凝胶表现出理想的纳米级纤维排列和突出的促血管生成生物活性的双重影响，通过利用免疫-血管生成-神经原性微环境的三元协同作用来促进糖尿病伤口愈合。我们的研究结果阐明了高度定向的纳米纤维显著调节多细胞行为，包括促进内皮细胞血管化、巨噬细胞中形状诱导的抗炎转变、雪旺细胞的形态发生成熟和成纤维细胞定向的ECM沉积，展示了优化多种微环境的能力。值得注意的是，增强的血管生成特征加强了相间串扰，最大限度地增加了免疫-血管生成-神经生成生态位的互锁连接。此外，在糖尿病大鼠模型中，生物活性各向异性亲水凝胶显著加速伤口愈合和有效的基质重建。总之，我们的工作强调了用简单的各向异性结构调节多维微环境的重要性，提高了其在慢性伤口愈合中的有效性。

论文链接（DOI）：

https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2025.01.004