Cell丨一朝被蛇咬，十年怕井绳：应激导致恐惧记忆泛化的机制

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《动物行为实验指南》共674页，涵盖了常见的实验动物，如小鼠、大鼠和斑马鱼，详细描述了每一种行为测试的实验设计、测试设备、实验流程、评估指标、预期结果、常见问题及解决方法、数据分析、模型应用与局限性等各个方面。它通过快速引导，帮助研究人员高效地掌握实验的每个阶段，减少了查阅文献和寻找方法的时间，成为各类科研人员的重要参考资料。 《动物行为实验指南》共计收录了16种动物行为类型，包括焦虑抑郁、学习记忆、痛觉、运动、恐惧、社交、癫痫、操作、成瘾、视觉、痒觉、味觉、嗅觉、睡眠、斑马鱼行为以及常见动物模型等内容。每一类动物行为下，都详细介绍了多个经典的实验范式，涵盖了超过100种实验方法。

在日常生活中，我们的大脑会不断根据经历的事件更新和存储记忆。这一过程，尽管为我们提供了生存所需的适应性，仍有可能在特定情境下产生副作用，尤其是在遭遇应激时。创伤后应激障碍（PTSD）便是一个典型的例子，它让我们思考，为什么某些人会在没有威胁的情况下对过去的创伤性记忆产生过度反应？想象一下，若你曾因一次特定的事件而感到恐惧，记忆的泛化可能让你将所有类似的情境都视为潜在威胁。这种现象，虽然为应对危险提供了警觉，却在许多精神疾病（如PTSD）中成为了根源。

近年来，神经科学的研究者们揭示了大脑某些区域，尤其是杏仁核在情感记忆形成中的关键作用。杏仁核，不仅帮助我们存储和回忆威胁相关的记忆，还对如何在类似情境中作出反应起着决定性作用。然而，在应激状态下，杏仁核的功能可能发生变化，从而导致记忆的泛化——这种泛化使得个体将原本仅限于特定威胁的记忆，错误地扩展到无威胁的环境中。但应激状态导致恐惧记忆泛化的环路和分子基础尚不清楚。2025年1月，来自加拿大多伦多大学的Sheena A. Josselyn团队在Cell杂志发表文章《Stress disrupts engram ensembles in lateral amygdala to generalize threat memory in mice》，通过精妙的实验设计，探讨了应激和皮质醇（CORT）如何通过改变杏仁体中的记忆表征集合的大小和组成，导致恐惧记忆的泛化。

图1：急性约束应激（RS）和全身皮质醇（CORT）注射引起的威胁记忆泛化

首先作者利用经典的条件性恐惧记忆实验范式，CS+（7.5 kHz声音）与CS-（2.8 kHz纯音）在训练中分别与电击（foot shock）和非电击配对。对照组小鼠对CS+的反应更强（即更多的freezing行为），表现出特定的记忆（CS+冻结 > CS-冻结）。而约束应激（RS）组小鼠，在训练前30分钟进行应激处理后，显示出记忆泛化的现象（即对CS+和CS-的freezing行为相同）。同时，通过统计记忆泛化分数generalization score可见应激组小鼠确实产生了明显的恐惧记忆泛化行为。应激往往会伴随着皮质醇的升高，因此作者在RS小鼠给药皮质醇合成抑制剂米氮平（metyrapone），结果发现能恢复RS小鼠的记忆特异性。那么皮质醇受体是否也发挥着这样的作用呢？因此，作者在杏仁核注射皮质醇受体拮抗剂RU486，发现也能恢复RS小鼠的记忆特异性。最后，作者直接对小鼠注射了皮质醇，通过检验血液皮质醇浓度，发现RS组显著高于对照组，而注射皮质醇组最高，行为学结果发现皮质醇注射显著引发了小鼠的恐惧记忆泛化行为。

图2：全身CORT注射通过增加杏仁核记忆印迹表征集合的大小引起恐惧记忆泛化

为了找到恐惧记忆的印迹细胞（engram cells），作者设计了多种正交的兴奋性依赖的神经元标记策略：TRAP2-TdT系统、RAM系统和c-Fos直接染色，因为前两种系统分别需要4-OHT和DOX撤除的启动，因此该策略能够分别特异的标记训练过程，CS+ test过程（恐惧记忆发生），和CS- test过程（恐惧记忆泛化）中兴奋的神经元。结果显示：1）CORT（皮质醇）注射显著增加了训练中活跃的神经元数量。2）CORT对CS+测试中的神经元活跃度没有显著影响，这表明，尽管CORT增强了训练阶段的神经元激活，但没有影响后续条件恐惧记忆相关的神经元反应。3）CORT注射显著增加了CS-测试中活跃的神经元数量，CORT注射增强了cFos+和TdT+神经元的共定位，表明CORT处理导致了CS-测试中更多的记忆重现，CORT注射增加了训练中活跃的神经元在CS-测试中的活跃概率，这表明CORT增加了训练过程中活跃神经元在非威胁刺激（CS-）下的反应，使得记忆更加泛化。那么CORT是怎么增加了这群记忆印迹表征的细胞呢？Sheelyn课题组之前的工作发现Engram cells的分配是兴奋性依赖的（详情可见2024年5月17日脑声常谈解读），因此通过病毒载体（HSV-NpACY）激活（ChR2，蓝光）或抑制（NpHR3.0，红光）同一小群杏仁核兴奋性神经元。通过蓝光在训练前激活特定神经元，研究者能够偏向这些神经元的激活，进而研究它们是否参与了记忆表征的形成。然后，使用红光抑制这些神经元，检测它们在记忆重现中的作用。在CS+测试中，CORT组的抑制效果比VEH组更为明显，这表明CORT处理通过改变记忆表征的组成，使得更多非高兴奋性神经元被纳入到表征集合中。

图3：CORT注射通过降低杏仁核PV+神经元在训练中的活动引起恐惧记忆泛化

那么为什么CORT的注射会导致恐惧记忆泛化呢？杏仁核中主要存在兴奋性神经元（CaMKII）和PV阳性的抑制性神经元，因此作者分别用光纤法记录了训练过程中两类神经元兴奋性的变化，结果发现给予CORT后，PV神经元对电击的响应明显降低，并且，利用化学遗传学的方法，作者发现，在训练过程中激活PV阳性神经元能够消除CORT带来的恐惧记忆泛化，而激活抑制它们则导致恐惧记忆泛化的加强。

图4：恢复杏仁核中的内源性大麻素AEA水平恢复CORT引起的恐惧记忆泛化

为了进一步研究恐惧记忆泛化的机制，作者又研究了内源大麻素在其中的作用。内源大麻素主要包括AEA和2-AG两种，首先作者发现在恐惧记忆训练过程中，急性束缚模型和CORT组中均可见AEA浓度的上升。之后作者通过个各种药理学的操纵方法，调控两种大麻素的效应。利用DO34降低2-AG的合成，可见同时影响了对照组和CORT的freezing行为。然而利用LEI-401抑制AEA的合成，则可以发现更显著的降低CORT导致的恐惧记忆泛化的现象，而利用FAAH的sgRNA及抑制剂URB597则能增强这种恐惧记忆的泛化，这证明了内源大麻素在恐惧记忆泛化过程中的重要作用。

图5：eCB通过PV阳性神经元上的CB1R调节CORT引起的恐惧记忆泛化

既然AEA如此重要，那它的受体是否也发挥了重要的作用呢？首先作者发现了在前杏仁核（anterior BLA）CB1R和PV有接近一半的共定位，之后作者使用ChRmine（一种兴奋性光遗传学工具）表达在杏仁体的PV+神经元中，通过AAV-DIO-ChRmine在PV-Cre小鼠中的表达。结合膜片钳技术，作者发现给予CB1R抑制剂WIN55之后，PPR升高，即囊泡释放的能力减弱，之后作者又利用光纤法结合大麻素探针检测了在训练过程中大麻素的释放，结果发现，CORT确实使得电击引发的兴奋性神经元兴奋性增加，而PV神经元接收到的大麻素信号也增加吗，但CORT并没有改变钙信号和大麻素信号的同步性。综上所述，作者揭示了内源性大麻素通过CB1受体在杏仁体PV+神经元上的逆行调节作用，如何促进CORT引起的威胁记忆泛化。

图6：PV+神经元中敲低CB1受体恢复CORT引起的恐惧记忆特异性和记忆表征集合大小

作者利用DIO-sgRNA特异性地敲低了PV神经元中的CB1R, 体外电生理数据表明敲低CB1R后WIN55不能导致IPSC频率的降低，说明sgRNA成功敲除了PV神经元中的CB1R，同时，与对照组小鼠相比，敲低组给予CORT，或进行约束性应激刺激后并没有发现明显的恐惧记忆泛化的现象。之后利用图2的范式研究敲低是否能影响恐惧记忆印迹表征集合的大小，结果发现敲除CB1R后也并不能发现CORT导致的恐惧记忆印迹细胞比例增加的现象。综上所述，作者提出了应激导致恐惧记忆泛化的机制的模型：应激会导致杏仁核产生更多的AEA，之后降低PV神经元的GABA的释放，增加兴奋性神经元的活动，根据engram cell allocation的理论，则会有更多的细胞分配成恐惧记忆的印迹细胞，增加了该记忆印迹的集合表征大小，最终产生了恐惧记忆的泛化。

图7：靶向皮质醇和AEA水平的药物在约束应激小鼠中能恢复恐惧记忆的特异性

为了说明该理论具有一定的临床价值，即是否能够帮助PTSD的患者避免泛化的恐惧记忆，作者利用已有的靶向皮质醇受体拮抗剂（RU486）和降低AEA合成的LEI-401，结果发现，两种药物均能一定程度上恢复约束应激小鼠的恐惧记忆特异性，避免恐惧记忆的泛化。

总结

本研究探讨了应激和皮质醇通过内源性大麻素系统在杏仁核中调节记忆泛化的机制。研究发现，CB1受体在PV+神经元上的作用通过逆行信号调节，促进了恐惧记忆的泛化。通过调节内源性大麻素AEA水平和CB1受体的活性，研究者成功恢复了应激引起的记忆特异性，揭示了内源性大麻素和皮质醇受体作为潜在治疗靶点在应激相关记忆失调，如PTSD等疾病中的应用前景。

本文主要研究的是恐惧记忆，但是记忆也包括非恐惧记忆等。那关于其他的记忆，如何被内源大麻素系统调节？其他记忆的印迹细胞和恐惧记忆有何不同？这也可能是之后需要研究的科学问题。

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