Nature Plants | 中国农大/中科院遗传发育所合作开发植物高效精准大片段DNA操纵及染色体编辑技术

基因组结构变异（Structural Variants, SV）是植物遗传多样性的重要来源，也是基因组进化和优异农艺性状形成的重要驱动力。因此，探究如何高效精准地操纵植物基因组结构变异对植物性状改良和农业生物育种具有重要意义。目前，基于CRISPR/Cas的基因组编辑技术，包括Cas核酸酶、碱基编辑（Base editors, BE）和引导编辑（Prime editor, PE）等，已在植物性状改良中得到了广泛的应用。然而，这些技术的编辑尺度大部分情况下仍局限于少数几个核苷酸的替换、删除和插入。尽管CRISPR/Cas9结合双sgRNAs能够在植物中实现基因组大片段DNA的删除和倒位等操纵，但其效率较低，并且由于该策略依赖于DNA双链断裂（Double strand breaks, DSBs）的产生，编辑产物中常常会引入许多非预期的编辑，甚至导致复杂的染色体重排。因此，开发不依赖于DSBs、高效且精准的植物大片段DNA和染色体操纵技术，对植物遗传改良具有重要意义，是植物染色体工程和生物育种技术创新的迫切需求。

1月13日，中国农业大学小麦研究中心与中国科学院遗传与发育生物学研究所合作在Nature Plants上在线发表了题为Precise deletion, replacement, and inversion of large DNA fragments in plants using dual prime editing研究论文，开发了一种高效且精准的植物基因组大片段DNA操纵技术——DualPE。

该技术能够在单子叶植物普通小麦以及双子叶植物本氏烟草和番茄中高效实现kb至Mb级的染色体片段精准无缝的删除、替换和倒位。具体开发思路为：利用植物高效引导编辑系统（Ni et al, Genome Biology, 2023），在目标编辑的染色体片段的两端以PAM-in的形式创制一对反向的3′ DNA flaps。通过对这两个3′ DNA flaps的序列和配对方式进行操纵，诱导细胞内的DNA修复方式发生相应的改变，从而实现该染色体片段的精准无缝删除、替换和倒位（图1）。

首先，当两个3′ DNA flaps与彼此靶位点区域的DNA序列互补配对时，经过DNA修复，理论上可以实现靶向位点之间大片段DNA的精准删除（图1）。对小麦7个内源片段（507bp-365.9kb）进行删除效率与精准度测试，发现DualPE在大多数位点上的编辑效率高于对照组（WT-DualPE和Cas9）或至少相当。且DualPE完全精准编辑的产物比例（平均为95.3%）明显高于对照组。遗传转化结果表明，DualPE能够在小麦个体水平高效创制365.9kb和2Mb的染色体片段精准删除的突变体。这一方法的精准性和可操纵性证明了DualPE具备开放阅读框内删除（in-frame deletions）和多片段同时删除的潜力。其次，当两个3′ DNA flaps包含外源目标插入片段且两个3′ flaps序列部分互补时，经过DNA链的延伸和修复，理论上可实现靶向区域的大片段DNA精准替换。小麦原生质体测试结果表明，DualPE可将超过250kb的序列替换为~90bp的序列。通过小麦遗传转化，DualPE成功创制了TaVRT-A2基因的内含子序列替换的小麦突变体（560bp的转录抑制元件替换为157bp的增强子元件），从而使该基因在穗部上调表达，获得了穗长和粒长明显增加的小麦材料。该结果凸显了DualPE在修改调控元件和改变基因表达模式方面的潜力，同时也为基因组原位标签插入提供了有效的方法。再次，如果两个3′ DNA flaps分别与目标倒位区域左右末端序列互补配对，就可以改变DNA复制方向，经过DNA修复，最终实现靶向区域的大片段DNA精准倒位（图1）。小麦原生质体测试结果表明，DualPE可实现~700bp-252kb的大片段DNA倒位，且其精准度均达到95%以上。小麦遗传转化结果表明，该系统可以在小麦个体水平实现基因组7.4kb-205.4kb的高效精准倒位，突变率为21.9-51.5%，其中两个基因(GASR7和SOG1)启动子的交换，导致这两个基因各自的表达模式发生转变。DualPE介导的大片段倒位技术为染色体定向重排、基因表达模式调控以及打破基因连锁等提供了强有力的工具。

此外，针对双子叶植物在精准基因组编辑技术，尤其是大片段精准编辑工具开发方面的不足，该研究同时探索了DualPE系统在双子叶植物中的编辑潜力。该研究首先对适用于双子叶植物本氏烟草和番茄的引导编辑载体进行了改造，分别使用了2×35S和EF1α启动子来驱动ePPEplus蛋白的表达。通过进一步的实验验证，发现DualPE在本氏烟草叶片基因组中能够实现长达134.7kb的删除、1.6kb的删除与66bp的替换、以及20.1kb的倒位。番茄原生质体和遗传转化结果表明，DualPE系统可以实现番茄基因组725bp-10kb的大片段删除、替换和倒位，效率高达72.7%，并且在T0代即可获得高达27.3%的纯合精准大片段编辑突变体。综合以上结果，DualPE系统不仅在单子叶植物中表现出色，还能高效实现双子叶植物大片段DNA精准编辑，是单双子叶植物染色体编辑的强大技术。

综上所述，该研究开发了一种高效精准的植物大片段DNA操纵和染色体编辑技术，拓展了植物精准基因组编辑的尺度，为复杂染色体结构变异的创制提供了新策略。同时，该技术也为生物育种技术的创新、植物合成生物学研究以及植物新性状乃至新型植物的创制提供了重要的技术支撑。为方便用户简单、快速使用该技术，该研究同时开发了网页版设计工具DualPE-Finder，旨在提供DualPE介导的大片段DNA编辑策略设计方案。

图1 DualPE介导的植物染色体片段的无缝删除、替换和倒位

中国农业大学小麦研究中心博士生赵一迪、硕士生黄正伟、博士生周希萌以及中国科学院遗传发育所的滕婉副研究员为该论文的共同第一作者。中国农业大学小麦研究中心宗媛教授和中国科学院遗传发育所王延鹏研究员为该论文的共同通讯作者。中国农业大学小麦研究中心的孙其信院士、倪中福教授、刘杰教授、郭伟龙教授，以及园艺学院张娜副教授对该工作给予了重要的指导和帮助。该项研究受到国家重点研发计划、生物育种重大专项、国家自然科学基金等项目的资助。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41477-024-01898-3

DualPE-Finder链接：

http://wheat.cau.edu.cn/DualPE_Finder/