Immunity | 李平卫实验室揭示cGAS-STING 通路第二信使cGAMP跨膜转运机制

病毒感染会引起强烈的先天免疫反应，诱导干扰素等细胞因子的表达，进而抑制病毒在细胞内的扩增。cGAS-STING信号传递通路是细胞内DNA感应的重要机制，在先天免疫反应过程中起到重要作用。cGAS被DNA激活后，催化合成第二信使环二鸟腺苷酸 （cyclic GMP-AMP, cGAMP） 。作为cGAS-STING通路下游重要的信息传递分子， cGAMP与定位内质网膜的STING分子结合，诱导STING的聚合，进一步激活蛋白激酶TBK1和下游转录因子IRF3，诱导干扰素基因的表达。作为第二信使的cGAMP 能否从被感染的细胞输出，被未感染细胞吸收，与STING结合并诱导干扰素的表达，成为大家比较关注的问题。尽管细胞如何吸收cGAMP 的机理已经得到比较深入的研究，cGAMP如何从被感染细胞运出一直不是十分清楚。西雅图华盛顿大学医学院Daniel Stetson实验室2022年在Immunity发表论文揭示ABC转运蛋白家族ABCC1能够从细胞中泵出cGAMP， 抑制cGAS-STING通路的激活，从而抑制依赖cGAS的自身免疫反应。

2025年1月6日，美国德克萨斯农业与工程大学李平卫博士实验室近期和Daniel Stetson等人合作在Immunity上发表了文章Structures of ATP-binding cassette transporter ABCC1 reveal the molecular basis of cyclic dinucleotide cGAMP export，利用冷冻电镜技术解析了人源ABCC1 以及它和cGAMP 复合物的分子结构，阐述了cGAMP跨膜转运机制。

研究人员首先确认了ABCC1参与cGAMP转运，cGAS和ABCC1 过量表达的细胞外 cGAMP和细胞内cGAMP相比明显提高，干扰素荧光素reporter的活化明显降低。然后他们从悬浮培养的293F细胞中纯化了人源ABCC1和绿色荧光蛋白的融合蛋白。他们发现大部分ABCC1以二聚体形式存在，只有少量蛋白以单体形式存在。活性测试证实ABCC1二聚体有很强的依赖于cGAMP的ATP酶活性。他们进一步用Split-GFP和激光共聚焦显微镜技术证实ABCC1在细胞膜上相互作用，形成二聚体。然后他们用冷冻电镜单颗粒三维重构技术解析了ABCC1的3.8 埃分辨率分子结构。很有趣ABCC1形成一个由N末端跨膜结构域 (TMD0) 介导二聚体。第二个ATP结合结构域 (NBD2) 显示出明显柔性，没有明显的密度（图一）。为了进一步证实ABCC1二聚体与其cGAMP转运活性相关，他们突变了参与ABCC1相互作用的氨基酸残基P1120，这一突变 （P1120F） 降低了ABCC1的cGAMP转运活性以及干扰素荧光素reporter的活化。

图一：人ABCC1 二聚体的结构

为了弄清ABCC1 转运cGAMP的分子机制， 研究人员进一步解析了ABCC1与cGAMP复合物的3.54埃分辨率的分子结构，在ABCC1二聚体中的一个ABCC1分子的结合口袋发现明显的cGAMP 密度（图二）。ABCC1通过一个带正电荷的口袋和一个疏水口袋与cGAMP结合（图二）。这个结合口袋大致和另外一种ABCC1底物LTC4的结合口袋重合。与cGAMP的结合似乎影响ABCC1的构象，研究人员利用部分精选数据得到了完整的ABCC1 4.32 埃分辨率的结构。当ABCC1与cGAMP结合后，第二个ATP结合结构域 （NBD2） 柔性减弱并靠近第一个ATP结合结构域 （NBD1） ，为下一步结合ATP，泵出cGAMP做好准备。基于这个与cGAMP结合的ABCC1 的结构，研究人员设计了一系列ABCC1的突变体并检测了他们转运cGAMP和诱导干扰素荧光素reporter的活性。实验结果表明突变两个重要的与cGAMP相互作用的残基R1197 和R1249都会严重影响ABCC1活性。

图二：ABCC1 与cGAMP复合物的结构，右图展示cGAMP结合口袋表面电荷分布，蓝色表面带正电荷。

ABCC1转运cGAMP的最后一个步骤是ABCC1与ATP结合，诱导ABCC1构象变化并将cGAMP释放到膜外。研究人员试图解析ABCC1 和ATP 复合物的结构，可惜这一尝试没有获得成功，但是基于牛源ABCC1和ATP复活物的结构，他们建立了人ABCC1与ATP复合物的同源结构模型。和这项工作解析的两个结构一道，这一系列结构与功能研究揭示了cGAMP从细胞中泵出的分子机制。

北卡罗来纳大学教堂山分校张琦博士实验室在电镜数据收集和结构解析工作中的重要贡献，华盛顿大学Daniel Stetson博士实验室协助进行了ABCC1 KO细胞相关的工作，杰克逊实验室的Phillip West博士实验室提供ABCC1激光共聚焦显微数据，德州农工大学隋学武博士对ABCC1和cGAMP复合物结构解析做出重要贡献。这项研究工作是李平卫博士实验室研究生Omkar Shinde 博士论文的核心内容，他对这项研究做出了重要贡献。

在过去十几年中李平卫博士团队对cGAS-STING信号传递通路的分子机理进行了深入系统的研究。利用X-射线晶体学和冷冻电镜技术，他们在2012年就解析了STING 和环二核甘酸c-di-GMP的结构 （Shu et al. NSMB ,2012） ，2013年他们揭示了cGAS被dsDNA激活的分子机理 （Li et al. Immunity, 2013） ，2016年他们实验室揭示了STING招募并活化转录因子IRF3的分子机理（Zhao et al. PNAS, 2016), 2019年他们揭示了STING招募和激活蛋白激酶TBK1的分子机制 （详见BioArt报道：） ，2020年，他们的研究揭示了cGAS与核小体紧密结合进而被抑制的分子机制 （详见BioArt报道：） 。这一领域还有许多非常有趣的问题值得进一步探索，结构生物学显然是研究这些问题的强有力手段。

作为先天免疫中的核心的信号传递通路，cGAS-STING通路的研究对于理解先天免疫机制、开发新型药物以及治疗自身免疫疾病都具有相当重要意义。通过深入探索cGAS-STING通路如何被激活和被调控，人们可以更好地应对感染、自身免疫性疾病，以及肿瘤等疾病的威胁，为促进人类健康做出重要的贡献。

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2024.12.002

制版人：十一

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