Phytomed | 西北大学揭示人参皂苷CK通过调控ASK1-MKK7-JNK信号通路抑制铁死亡减轻脑衰老

大脑衰老是神经退行性疾病发病和进展的主要因素。这些疾病的常规治疗通常受到显著副作用的限制，并且在阻止疾病进展方面缺乏疗效。人参皂苷化合物K （CK）是一种从人参中提取的具有生物活性的次级代谢产物，因其强大的抗氧化特性而显示出良好的前景。

2024年11月10日，西北大学化学工程学院西部资源创新医药绿色制造教育部工程研究中心范代娣教授团队在Phytomedicine上在线发表题为“Ginsenoside compound K alleviates brain aging by inhibiting ferroptosis through modulation of the ASK1-MKK7-JNK signaling pathway”的文章。CK靶向ASK1并抑制MAPK激酶7 （MKK7）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）的过度磷酸化，通过抑制铁死亡的发生来改善脑老化。

•人参皂苷compound k （CK）延缓d-半乳糖诱导的C57BL/6小鼠的脑老化。

•CK通过改善线粒体功能障碍减轻脑老化。

•CK通过抑制铁死亡的发生来改善脑老化。

•ASK1-MKK7-JNK信号通路介导CK抑制铁死亡。

摘要

我们采用d-半乳糖（D-gal）诱导的PC-12衰老细胞模型和小鼠脑衰老模型来探索CK在脑衰老背景下的抗氧化特性。采用免疫荧光和western blot技术检测CK对脑衰老相关线粒体功能障碍的影响。通过转录组学分析和蛋白质印迹法研究CK影响脑衰老的潜在分子机制。此外，通过分子对接、微尺度热电泳和小干扰RNA转染验证CK对凋亡信号调节激酶1 （ASK1）的调控作用。我们的研究结果表明，CK可有效缓解与脑老化相关的认知功能下降。CK可减少衰老细胞数量，减轻神经元损伤，增强过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等关键抗氧化酶的活性。此外，CK恢复线粒体功能，上调溶质载体家族7成员11和谷胱甘肽过氧化物酶4的表达，从而抑制铁死亡。此外，CK靶向ASK1并抑制MAPK激酶7 （MKK7）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）的过度磷酸化。这种抑制促进核因子e2相关因子2 （nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）在核内蓄积，有效减少与脑衰老相关的铁死亡和氧化损伤。综上所述，我们的研究表明，CK通过抑制ASK1-MKK7-JNK信号通路、增强核内Nrf2表达以及抑制铁死亡反应来有效延缓脑衰老。这些发现强调了肌酸激酶是一种有前景的治疗药物，可以减缓大脑老化和缓解神经退行性疾病。

1.CK可抑制PC-12细胞衰老

为了探究CK对PC-12细胞衰老的影响，我们通过培养细胞并通过添加d-gal诱导衰老的方法建立了PC-12细胞衰老模型（图2A）。首先，我们利用MTT法评估了d-gal和CK对PC-12细胞的细胞毒性作用。结果表明，15 mg/ml的d-gal和20µM的CK对PC-12细胞没有表现出任何细胞毒性作用（图2B和C）。SA-β-Gal被广泛认为是细胞衰老的重要指标。SA-β-Gal染色显示d-gal处理后衰老细胞数量显著增加（黑色箭头）。相反，CK（10µM和20µM）处理后衰老细胞的数量显著减少（图2D和图E）。此外，与浓度较低的CK（10µM）相比，浓度较高的CK（20µM）对细胞衰老的抑制作用更明显。除SA-β-Gal外，8-OHdG和AGEs也是评估衰老的重要生物标志物，与衰老过程密切相关。我们的分析表明，CK处理有效地逆转了d-gal诱导的8-OHdG和AGEs表达水平的上调（图2F和G）。ROS的积累是细胞衰老过程中氧化应激和线粒体功能障碍的结果。流式细胞术检测到d-gal处理的PC-12细胞中ROS水平显著升高。值得注意的是，CK处理显著减少了d-gal诱导的ROS产生（图2H）。通过检测PC-12细胞中过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，进一步评估CK对细胞衰老相关氧化应激的影响。我们的结果表明，d-gal处理组的CAT， SOD和GSH-Px活性显著降低。然而，CK处理显著减轻了氧化应激的进展（图2I-K）。综上所述，这些发现强调了CK对PC-12细胞衰老的抑制作用及其在氧化应激调节中的关键作用。

图1 CK可改善衰老小鼠的认知功能

图2 CK抑制PC-12细胞衰老

2.CK可改善衰老小鼠的认知功能和神经元损伤

在本研究中，我们建立了衰老小鼠模型（图1B），并使用Rapa作为阳性对照。Rapa被广泛报道具有抗衰老的特性，它通过抑制mTOR信号通路发挥作用。大脑衰老通常是认知能力下降的主要驱动因素。因此，我们对d-gal诱导的衰老小鼠的认知功能进行了系统的评估。在MWM空间导航实验中，衰老小鼠的逃避潜伏期较正常小鼠明显延长，而CK干预显著缩短了这一潜伏期（图1E）。探针测试中的代表性路径轨迹如图1D所示。与d-gal组衰老小鼠相比，CK处理组小鼠穿越原平台位置的次数明显增多，在目标象限停留的时间也明显增多（图1F和G）。值得注意的是，与Rapa处理组相比，高剂量CK处理组在增强衰老小鼠认知功能方面表现出更明显的效果。这些发现表明，CK对减轻衰老小鼠的认知功能下降有显著效果。鉴于神经元损伤是衰老过程的一个显著特征，我们使用尼氏染色来检测CK对老龄小鼠神经元的影响。CK可显著改善老龄小鼠的认知功能。在本研究中，我们评估了老年小鼠海马各亚区的神经元损伤（图3A）。在海马不同亚区，d-gal诱导的衰老小鼠与正常组相比，在CA1和齿状回（DG）区域出现了明显的病理改变。这些病理改变包括尼氏体数量明显减少、神经元变形和部分细胞溶解（黑色箭头）。值得注意的是，CK处理显著逆转了这些病理特征，并恢复了CA1和DG区神经元的有序排列（图3B）。定量分析表明，正常组和H-CK组的海马区存活神经元数量均显著高于D -gal组（图3C和D）。为了进一步阐明CK在减轻衰老小鼠神经元损伤中的作用，我们评估了这些小鼠大脑中CAT、SOD和GSH-Px的活性。结果表明，d-gal诱导的衰老小鼠大脑中CAT， SOD和GSH-Px的活性显著降低。然而，CK处理显著逆转了这些作用（图3E-G）。氧化应激在衰老过程中诱导胶质细胞活化。IF染色结果表明，CK可以逆转d-gal诱导的小胶质细胞和星形胶质细胞的活化（白色箭头，图3H和I）。此外，炎症反应在胶质细胞的活化中起着关键作用。RT-qPCR检测衰老小鼠海马区炎症因子IL-6和TNF-α的表达。值得注意的是，CK干预显著降低了这些炎症因子的表达（图3J）。综上所述，CK在改善d-gal诱导的衰老小鼠认知功能障碍和神经元损伤方面表现出显著的抗氧化和抗炎作用。

图3 CK可改善衰老小鼠神经元损伤

3.CK可改善衰老过程中线粒体功能障碍

然而，CK给药显著改善了这些线粒体形态异常，恢复到与正常组相当的水平（图4A）。利用荧光探针JC-1标记PC-12细胞线粒体膜电位；结果显示，d-gal组线粒体膜电位明显降低，表现为绿色荧光增加，红色荧光减少。然而，CK处理显著缓解了这一降幅（图4B和C）。由于线粒体是细胞的主要能量来源，因此线粒体功能障碍直接影响ATP的生成。我们发现CK处理后线粒体中的ATP含量显著恢复（图4D）。随后，在PC-12细胞中，我们评估了线粒体相关蛋白COX IV， ATP5A1和Mfrn1的表达。结果表明，CK显著上调COX IV和ATP5A1的表达，同时下调Mfrn1的表达（图4E-H）。值得注意的是，CK处理增加了d-gal诱导的衰老小鼠大脑中COX IV和ATP5A1蛋白水平，而抑制了Mfrn1蛋白水平（图4I-J）。综上所述，这些结果表明，CK治疗显著改善了与衰老相关的线粒体功能障碍。

图4 CK可改善衰老过程中线粒体功能障碍

4.CK通过铁死亡和ASK1-JNK通路减轻d-gal诱导的脑衰老

为了在分子水平上充分阐明CK的抗衰老效果，我们对各组衰老小鼠的脑组织进行了转录组测序分析。最初，主成分分析（principal component analysis， PCA）显示，与其他组相比，d-gal组的数据离散度明显增加（图5A）。此外，通过比较正常组和d-gal组、H-CK组和d-gal组的差异表达基因，我们在正常组和d-gal组的比较中发现了2368个显著差异表达基因，在H-CK和d-gal组的比较中发现了1639个显著差异表达基因（图5B）。进一步深入分析两组之间的共同差异表达基因，发现显著上调的基因有490个，显著下调的基因有548个（图5C）。利用基因本体论（GO）数据库进一步探索与差异基因相关的潜在生物学通路。我们发现差异表达的基因主要涉及细胞过程、生物过程的调节、细胞器成分和抗氧化活性（图5D）。随后，京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，CK主要调控与氧化应激相关的信号通路，包括铁死亡、kelch样ech相关蛋白1-Nrf2信号通路、ASK1-JNK信号通路（图5E）。然后，我们对差异表达基因进行了关键驱动分析。结果显示，铁死亡通路相关基因（SLC7A11、GPX4和铁蛋白）与ASK1-JNK信号通路相关基因（ASK1、MKK7和JNK）之间存在较强的相互作用（图5F和G）。为了进一步识别差异表达基因之间的关键靶基因，我们使用Cytoscape软件构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，将它们的相互作用可视化（图5H）。PPI分析显示，ASK1- jnk信号通路中的差异表达基因与铁死亡相关基因之间存在强烈的相互作用，其中ASK1在网络中占据中心位置。总之，RNA测序分析表明，铁死亡和ASK1- jnk信号通路可能在CK减轻d-gal诱导的衰老小鼠的脑衰老中发挥关键作用，其中ASK1可能是CK减轻衰老小鼠脑衰老的关键基因。

图5 CK通过铁死亡和ASK1-JNK减轻d-gal诱导的脑衰老

5.铁死亡在d-半乳糖诱导的PC-12细胞衰老中发挥重要作用

为了进一步阐明铁死亡对衰老的影响，我们研究了各种细胞抑制剂对d-半乳糖诱导的PC-12细胞衰老的影响。此程序图示于图6A中。AGEs被认为是衰老的标志物。IF染色显示d-gal处理导致衰老细胞中AGEs的数量明显增加。有趣的是，铁死亡特异性抑制剂Ferrostatin-1 （Fer-1）显著减少了PC-12衰老细胞中的AGEs数量（图6C和E）。随后，我们检测了衰老细胞中铁蛋白、SLC7A11和GPX4（参与铁死亡的关键蛋白）的表达。WB分析显示，铁蛋白、SLC7A11和GPX4在d-gal诱导的衰老PC-12细胞中显著下调（图6F）。总之，这些发现表明铁死亡在d-gal诱导的PC-12细胞衰老中起着重要的作用。

图6 铁死亡在d-半乳糖诱导的PC-12细胞衰老中发挥重要作用

6.肌酸激酶通过抑制铁死亡激活改善d-半乳糖诱导的小鼠脑衰老

随后，我们检测了CK对衰老小鼠脑铁死亡的影响。MDA和4HNE是脂质过氧化的产物，是氧化应激的标志物，与铁死亡密切相关。衰老小鼠脑组织中MDA和4HNE含量显著升高。然而，CK处理显著改善了这一效应（图7A和B）。此外，CK处理降低了铁死亡标志物Ptgs2的表达（图7C）。细胞内不稳定铁的积累是铁死亡的重要触发因素。我们观察到，衰老小鼠大脑中的不稳定铁水平显著增加，但在给予CK后下降（图7D）。SLC7A11、GPX4和Ferritin是铁死亡密切相关的关键分子，在铁代谢、抗氧化防御和铁储存的调节中发挥重要作用。WB分析显示，SLC7A11、GPX4和Ferritin水平在衰老小鼠中显著下调。值得注意的是，CK处理显著逆转了这一趋势（图7E-H）。同样，IF也得到了一致的结果（图7I）。GSH作为GPX4的还原剂，直接影响其活性和抗氧化能力。充足的GSH水平对于预防铁死亡至关重要。我们发现衰老小鼠大脑中的GSH水平和GSH/GSSG比值显著降低。这些减少被CK逆转（图7J和K）。总体而言，这些发现表明CK抑制了衰老小鼠脑内的铁死亡。

图7 肌酸激酶通过抑制铁死亡激活改善d-半乳糖诱导的小鼠脑衰老

7.CK以ask1依赖的方式减轻脑衰老

结合KEGG分析结果（图5E），本研究在体内外实验中揭示了氧化应激相关基因Nrf2在CK抑制铁死亡中的作用。值得注意的是，Nrf2是SLC7A11和铁蛋白的潜在治疗靶点，与铁死亡密切相关。WB显示，在d-gal诱导的PC-12衰老细胞和衰老小鼠大脑中，核Nrf2表达均降低。相比之下，CK处理后Nrf2的核内积累明显增加（图8A-C）。同样，IF染色表明，CK处理显著增强了衰老小鼠大脑中Nrf2的荧光强度（由白色箭头表示）（图8D）。ASK1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是氧化应激信号传导的关键调节因子。越来越多的证据表明，持续的氧化应激导致ASK1的过度磷酸化和MKK7和JNK的过度活性，最终加剧氧化应激。同样，抑制ASK1超活化会增加Nrf2的核内积累，从而减轻氧化应激和减少铁死亡。WB分析显示，在d-gal诱导的衰老细胞和老龄小鼠大脑中，CK显著抑制ASK1及其下游蛋白MKK7和JNK的过度磷酸化（图8E-L）。

图8 CK以ask1依赖的方式减轻脑衰老

分子对接进一步研究了CK和ASK1之间的潜在相互作用。结果表明，CK与ASK1通过氢键与残基Thr836和Glu724结合，以及涉及Ala727、Leu728和Lys827的烷基的疏水作用（图9A-C）。此外，CK与ASK1的结合能为−7.067±0.15 kcal/mol（图9D和图E），表明CK与ASK1蛋白之间存在高亲和力的相互作用。此外，我们利用MST分析检测了CK和ASK1之间的结合作用。如图9F所示，热泳曲线呈剂量依赖性交互作用，随着CK浓度的增加，ASK1荧光强度逐渐降低。Kd值为0.93±0.4 μM（图9G），表明CK和ASK1之间具有很强的特异性亲和力。综上所述，这些发现表明ASK1是CK减轻小鼠脑老化的关键靶点。综上所述，CK通过抑制ask1相关通路的过度激活，促进Nrf2的核内积累，从而延缓衰老过程中铁死亡的激活。

图9 CK以ask1依赖的方式减轻脑衰老

8.ASK1介导CK抑制铁死亡以改善d-gal诱导的PC-12细胞衰老

为了进一步阐明ASK1在ck介导的抑制铁死亡和改善PC-12细胞衰老中的作用，我们使用siRNA转染技术将si-ASK1转染到PC-12细胞中，以特异性敲低ASK1的表达，如图10A所示。用RT-qPCR检测转染72 h后ASK1基因的表达。结果显示，si-NC组的ASK1表达显著高于si-ASK1组（图10B），证实si-ASK1成功敲低。MTT实验检测si-ASK1和CK处理对衰老PC-12细胞活力的影响。与si-NC组相比，si-ASK1组和si-ASK1+CK组均未观察到显著的细胞毒性（图10C）。然后，我们探索了CK是否通过调节ask1相关通路蛋白发挥作用。与si-NC组相比，si-NC+CK组p-ASK1和p-JNK的表达水平明显降低，Nrf2的核内积累明显增加，与单独CK处理的结果一致（图8E）。同样，si-ASK1组p-ASK1和p-JNK的表达水平降低。虽然与si-ASK1组相比，si-ASK1+CK组的p-ASK1和p-JNK水平进一步降低，但差异无统计学意义（图10D和E）。最后，我们检测了铁死亡相关通路的关键调节因子。MDA分析显示，si-ASK1+CK处理显著降低衰老PC-12细胞的脂质过氧化水平，与si-NC+CK组观察到的效果相似（图10F）。此外，与si-NC组相比，si-NC+CK和si-ASK1处理的衰老PC-12细胞中GSH水平和GSH/GSSG比值显著升高（图10G和H）。这些发现表明，CK对衰老PC-12细胞铁死亡的保护作用是通过ASK1调控介导的。综上所述，CK可以靶向抑制ASK1的过度磷酸化，从而抑制脑衰老过程中铁死亡的激活，最终延缓衰老进程。

图10 ASK1介导CK抑制铁死亡以改善d-gal诱导的PC-12细胞衰老

结论

综上所述，CK通过改善认知功能、减少氧化应激、保护神经元和维持线粒体功能来缓解脑老化。CK阻止ASK1-MKK7-JNK通路的过度激活，从而增强Nrf2的核内积累，有效减少脑老化过程中的铁死亡和氧化损伤。这些发现表明，CK是与脑老化相关的神经退行性疾病的潜在治疗药物。

Yan X, Bai X, Sun G, Duan Z, Fu R, Zeng W, Zhu C, Fan D. Ginsenoside compound K alleviates brain aging by inhibiting ferroptosis through modulation of the ASK1-MKK7-JNK signaling pathway. Phytomedicine. 2024 Dec;135:156239. doi: 10.1016/j.phymed.2024.156239

中医药基础科研服务：

相关咨询，加微信：1278317307。

【福利时刻】科研服务（点击查看）：、、、、、。咨询加微信：1278317307。