J Neuroinflamm︱闸门失守，洪水泛滥；少了CCR2，免疫反应过激伤脑

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动物行为学实验是神经科学研究领域的重要组成部分，主要侧重于科学客观地评价各种条件下的动物行为。动物行为学实验种类繁多，研究不同的疾病模型时，研究人员需根据关注的具体行为选择合适的研究手段。《动物行为实验手册》为学习记忆类、抗焦虑抑郁类、抗疲劳类、神经精神类、痛觉测试类、嗅觉测试类、社会行为类及特定行为评估类等，其中许多实验需要借助特制的仪器、记录及分析系统。

2024年12月27日，美国华盛顿大学Robyn S. Klein团队在Journal of Neuroin­ammation发表“CCR2 restricts IFN-γ production by hippocampal CD8 TRM cells that impair learning and memory during recovery from WNV encephalitis”，揭示了CCR2限制海马体CD8组织驻留记忆细胞产生干扰素-γ，而这些细胞会在西尼罗河病毒脑炎康复期间损害学习和记忆能力。

西尼罗河病毒（WNV）可以导致人类罹患神经系统疾病甚至死亡。西尼罗河病毒在非洲、欧洲、中东、北美和西亚很常见，以鸟和蚊子之间的传播循环而在自然中存在，人类、马和其他哺乳动物都可能被感染。西尼罗河病毒是黄病毒属的一种，与日本脑炎抗原复合物同属黄病毒属。表达干扰素-γ（IFN-γ）的中枢神经系统驻留记忆CD8 T细胞（TRM）会促使神经退行性病变过程发生，包括突触丧失，进而导致记忆受损。作者发现，从MNV引起的中枢神经系统感染康复后，海马中持续存在的CD8 TRM中的CCR2信号传导，能显著预防记忆障碍的发生。通过使用CCR2缺陷型小鼠确定在急性WNV感染期间，CCR2的表达对于中枢神经系统T细胞的募集或病毒控制并非至关重要。然而，对WNV感染康复期前脑CCR2阳性与CCR2阴性CD8 TRM进行转录组分析显示，CCR2信号传导通过外在和内在作用显著调节海马CD8 TRM的表型和功能，分别限制CD103、颗粒酶A和IFN - γ的表达，并增加病毒特异性CD8 T细胞的百分比。WNV感染康复后的Cd8acreCcr2f/f小鼠表现出识别记忆能力下降。总体而言，这些数据表明CCR2信号传导参与调节CD8 TRM表型，包括抗病毒特异性和IFN - γ表达，突出了CCR2在限制CD8 T细胞介导的神经炎症和认知缺陷方面的神经保护作用，为中枢神经系统感染的潜在治疗靶点提供了思路。

图一 CCR2阳性细胞在感染WNV后恢复的海马中持续存在

为了明确在WNV感染期间前脑内表达CCR2的常驻和浸润单核细胞群体，作者使用了Tmem119 GFP/+Ccr2RFP/+小鼠，并通过脑内接种10⁴ 个噬斑形成单位的WNV。在急性WNV感染期间及恢复后，与模拟感染的动物相比，感染后第7天齿状回（DG）内RFP阳性细胞增加。在感染后第25天，在齿状回、CA3和CA1区域检测到CCR2阳性RFP阳性细胞。与模拟感染的动物相比，在感染后第7天，CA3和齿状回区域内GFP水平检测不到，即神经炎症条件下小胶质细胞会下调TMEM119的表达。虽然在感染后第25天，TMEM119水平恢复到与模拟感染动物相当的水平，但IBA1水平在感染后仍然升高，表明包括小胶质细胞和少量持续存在的巨噬细胞在内的髓系细胞持续激活。

为了更好地量化急性WNV脑炎期间及恢复后CCR2阳性细胞亚群的动态变化，作者在感染后第7天、15天和25天通过流式细胞术检测了WNV感染的Tmem119 GFP/+Ccr2RFP/+小鼠前脑（皮质和海马）中这些细胞的动态变化。在所有时间点，约30%的CD45高表达（CD45hi）CD11b阳性细胞呈现单一RFP阳性。免疫组化显示，CD45hiCD11b⁺和CD45中表达（CD45mid）CD11b⁺细胞中GFP阳性率的增加与小胶质细胞的持续激活一致。随着时间推移，CD4和CD8 T细胞群体中RFP阳性细胞的百分比逐渐增加，与CD4 T细胞相比，CD8 T细胞的RFP阳性百分比更高。总体而言，这些研究结果确定了WNV感染及早期恢复期间前脑中各种单核细胞类型（CD45hiCD11b⁺、CD4和CD8 T细胞）中CCR2的表达模式。

图二 WNV感染后CD8特异性CCR2缺陷的转录组特征分析

作者利用Cd8aCre + Ccr2f/f小鼠研究CCR2在CD8 T细胞上的功能。对这些CD8 T细胞的流式细胞术分析证实，在WNV感染的Cre + 小鼠前脑免疫细胞中，它们仅表达GFP。在WNV感染恢复后的前脑中，GFP + CD8 T细胞的频率约为40 - 50%，与感染的Ccr2RFP/RFP小鼠中观察到的频率相似。在CD8 T细胞中缺失CCR2后，未观察到记忆细胞亚群的细胞组成发生显著变化。接下来鉴定出7种主要细胞类型，包括B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、γδ T细胞、小胶质细胞、单核细胞/巨噬细胞和神经元细胞。每个细胞簇的特征基因由与其他簇相比具有最高倍数变化的差异表达基因（DEGs）确定。将CD8 T细胞簇的DEGs与分离的CD8 T细胞RNA测序得到的DEGs进行交叉比对。所有比较均在CCR2基因敲除样本与CCR2野生型样本之间进行，从整体基因敲除与野生型小鼠的CD8 T细胞RNA测序分析得到的DEGs数量更多，这表明在整体CCR2缺陷时，非T细胞对CD8 T细胞转录组特征存在间接影响。使用基因集富集分析（GSEA）对scRNA - seq中重叠的DEGs进行检查发现，许多信号通路，如JAK - STAT信号通路和T细胞受体（TCR）信号通路受到CCR2缺失的显著影响。CD8组织驻留记忆细胞是WNV感染后前脑中表达Ifng和Itgae mRNA的主要细胞类型。与整体基因敲除动物不同，Cre + 动物中Itgae mRNA水平没有显著变化，这表明非T细胞中CCR2的充足性对CD8 TRM细胞中CD103表达存在外在影响。调节IFN-γ的转录因子Stat1、Stat4、Tbx21在Cre + 与Cre - 动物相比均增加，这与两种模型中CCR2缺陷情况下Ifng的上调一致。这些数据表明中枢神经系统CD8 T细胞的转录组变化受到CCR2的外在和内在调节。

图三 CCR2对海马体CD8 T细胞的干扰素-γ表达具有内在调节作用

为了在体内验证CCR2对CD8 T细胞功能的内在影响，作者培育出CCR2缺陷型WNV-I小鼠。在WNV感染前24小时，将从野生型WNV - I或CCR2缺陷型WNV - I小鼠脾脏中分离出的未致敏CD8 T细胞，过继转移到野生型受体小鼠体内，并在感染后30天收集受体小鼠的前脑，用于流式细胞术分析。几乎100%转移的CD8 T细胞为NS4B阳性。CCR2缺陷并不影响CD8 T细胞在前脑的留存，这证实CCR2与WNV感染后中枢神经系统中组织驻留记忆细胞的维持无关。值得注意的是，与表达CCR2的T细胞相比，CCR2缺陷型T细胞中干扰素-γ阳性率和平均荧光强度水平均更高。此外，几乎所有转移的WNV - I CD8 T细胞都表达CD103，并且与WNV感染恢复后的KO小鼠相比野生型小鼠，CD103表达和NS4B水平增加的结果一致。总体而言，这些结果证实了CCR2对WNV感染后中枢神经系统CD8 T细胞产生IFN-γ具有内在调节作用。

图四 WNV感染康复期CCR2缺陷对识别记忆的影响

作者之前的研究表明，在WNV感染恢复期间，T细胞产生的干扰素-γ会导致基于海马的记忆损伤。鉴于CD8 T细胞中CCR2失活会导致海马内IFN-γ表达增加，假设CCR2缺陷诱导产生的IFN-γ可能会对识别记忆产生负面影响，而在WNV感染恢复期间识别记忆通常不受影响。为了验证这一点，对感染WNV后恢复的Cre+和Cre-同窝小鼠进行了新物体识别（NOR）测试，在习惯化阶段，两组小鼠的总移动时间没有差异，这表明CD8特异性CCR2缺失对运动活动没有影响。在训练日，两组小鼠与两个相同物体相处的时间相似，对两者均无偏好。两组之间的探索次数相当，进一步证实了对相同物体无偏好。在测试阶段，Cre-小鼠对新物体表现出明显更强的偏好。Cre-小鼠与新物体互动的时间也显著更多，而Cre+小鼠在新物体和熟悉物体之间的探索时间没有显著差异。Cre-小鼠对新物体的探索次数明显高于Cre+小鼠。总体而言，CD8 T细胞中的CCR2信号传导在WNV感染后对识别记忆起到保护作用。

综上所述，本研究强调了CCR2在调控CD8 T细胞功能和神经炎症中的关键作用，特别是在WNV感染后的中枢神经系统。CCR2缺乏的CD8 T细胞在CNS中表现出升高的IFN-γ产生，加剧了从病毒性脑炎恢复期间的认知障碍。这些发现揭示了T细胞介导的神经炎症机制的重要见解，并提示在考虑使用CCR2拮抗剂治疗其他疾病时需谨慎，因为它们可能会通过破坏CCR2在CNS中的重要调节功能而引发神经副作用。总之，该研究为为中枢神经系统感染潜在治疗靶点提供思路。

文章来源

https://doi.org/10.1186/s12974-024-03309-y

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