常用内参种类/如何选择合适的内参？

1、全细胞：

β-actin：

肌动蛋白，细胞骨架蛋白。在各组织和细胞中的表达相对恒定，它广泛分布于细胞质内，表达量非常丰富。

➡️不适用情况：

细胞生长条件的改变以及与胞外基质组分的相互作用都可能会影响actin合成，另外脂肪组织中β-actin含量少。

GAPDH：

甘油醛-3-磷酸脱氢酶，该酶是糖酵解反应中的一个酶，表达相对恒定，且很少受外部诱导物的影响。

➡️不适用情况：

某些生理因素，如缺氧、糖尿病、肿瘤，会影响GAPDH表达。

β-tubulin：

微管蛋白，细胞骨架蛋白，表达通常不会发生改变。

➡️不适用情况：

抗微生物和抗有丝分裂药物使用可能会影响tubulin表达。

2、细胞核：

Lamin B1：

核纤层蛋白B1，是核纤层的结构部件用于支撑核被膜，也参与细胞周期中的核被膜解体和再形成。（核膜内参）

➡️不适用情况：

没有核被膜的样本，凋亡样本、胚胎干细胞也不适合Lamin B1。

Histone-H3：

组蛋白H3，是真核生物中负责染色体纤维核小体结构的五个主要组蛋白之一，常用作核内参勘误。

3、线粒体：

VDAC1：

电压依赖性阴离子通道蛋白1，是线粒体外膜上一种重要的跨膜蛋白，主要调控线粒体通透性和细胞能量代谢。

COXIV：

细胞色素C氧化酶亚基Ⅳ亚型1，是线粒体电子传递中的末端氧化酶，因此常作为线粒体的内参。

HSP60：

属于伴侣蛋白家族，在维持线粒体蛋白质稳态平衡方面起重要作用，可促进蛋白输入和组装。

4、细胞膜

ATP1A1：

钠/钾离子转运ATP酶α1肽[或称Na(+)/K(+) ATPase 1]，是膜结合酶Na+/K+-ATP的催化成分。作为普遍表达的膜蛋白，通常用作质膜蛋白的标记或内部控制。

5、全血/血浆/血清

Albumin：

白蛋白，是血浆中最丰富的蛋白质，因此作为内参时需注意上样量。

Transferrin：

转铁蛋白，是血浆中主要的含铁蛋白，顾名思义负责运载铁。

➡️不适用情况：

Transferrin表达状况受某些疾病状态和治疗的影响，比如视黄酸，因此在疾病模型中需要注意选择。

✨那么如何选择合适的内参呢？

1、目的蛋白分子量

选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD左右。

2、目的蛋白表达部位

➡️有些UU提取蛋白会选择胞浆、胞核分开提取，不提取总蛋白。β-actin在胞浆中表达高效稳定，而总蛋白主要成分就是胞浆蛋白，所以β-actin可以作为总蛋白的内参。

➡️理论上细胞核内不表达β-actin，所以不能用于核蛋白内参。内参自当选择与目的蛋白表达部位相同的蛋白才能有说服力。

胞浆和全细胞蛋白：

β-actin、GAPDH、Tubulin等；

胞核蛋白：PCNA、Histone H3等；

核膜蛋白：Lamin B等；

线粒体蛋白：COX IV、VDAC1等。

3、组织特异性

没有一种内参适用于所有组织和细胞，需根据具体情况进行选择。如：

‼️1、在脂肪组织里，β-Actin的表达量非常低，不适合作为内参。

‼️2、不同组织的细胞结构会有差异性，如脑组织的 tubulin 的表达会高一些，而 actin 的表达量可能会低一些。再比如，骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而导致了 tubulin 的表达改变和特化，这种情况可以选择GAPDH。

‼️3、缺氧和糖尿病等疾病存在下，会增加 GAPDH 在特定细胞和组织中的表达，不适合做内参。

‼️4、在加入抗癌和真菌药物时，tubulin表达受影响，不适合做为内参。

‼️5、血红细胞（因为其细胞结构的特殊性和需要携带氧气的功能性）样本就不适合常用内参。可以选用血红细胞的结构性蛋白作为内参代替。

‼️6、做各种分泌液样本的时候，如血浆，乳汁，组织液等，常用内参不适合。由于没有完整的细胞结构，所以只能选择一些分泌蛋白作为内参，或者采用其他方式作为内参。

‼️7、做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，选择结构蛋白作为内参，如Actin和Tubulin，因为 GAPDH 是代谢类蛋白，表达量有可能会受到诱导处理的影响。

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