连佳长团队构建毕赤酵母细胞工厂，成功实现硫酸胆固醇的高效合成

硫酸胆固醇（Cholesterol Sulfate, CS）是一种重要的生物活性分子，广泛应用于皮肤修复、神经保护等领域。然而，目前商业化生产硫酸胆固醇的主要方式依赖于从羊毛油脂中提取胆固醇，然后进行化学转化。这种方法不仅成本高昂，还严重依赖有限的自然资源，同时会产生大量副产物，对环境造成污染。因此，科学家们一直在寻找一种更加绿色、经济的生产方式。

最近，浙江大学连佳长课题组在ACS Sustainable Chemistry & Engineering 期刊发表文章，他们通过构建毕赤酵母（Komagataella phaffii）细胞工厂，实现了从简单碳源（如甘油）高效合成 CS。在补料发酵罐中，CS 产量达到 545 mg/L，为未来大规模生产其他硫酸化天然产物开辟了全新路径。文章题为“Establishing Komagataella phaffii as a Cell Factory for Efficient Production of Cholesterol Sulfate”。

研究的第一步是搭建能够合成 7- 脱氢胆固醇（7-DHC）的毕赤酵母平台。课题组通过基因编辑技术，敲除了内源性竞争性支路的两个关键基因ERG5 和 ERG6，避免了副产物的生成。此外，他们引入了外源基因 GgDHCR24，这是一个来源于鸡的酶基因，可以催化胆固醇前体的生成。实验结果显示，改造后的毕赤酵母菌株 DHC01 在培养基中产生了 35.6 mg/L 的 7-DHC，相较于传统工业用的酿酒酵母表现出显著优势。这一成果证实了毕赤酵母在合成类固醇化合物方面的潜力，为后续胆固醇和硫酸胆固醇的合成奠定了基础。

为了进一步实现 7-DHC 到胆固醇的转化，研究团队引入了来自斑马鱼的 DHCR7 基因。实验发现，这一基因的表达显著提升了胆固醇的产量：改造后的菌株 CH01 生产了 107.6 mg/L的胆固醇，比其亲本菌株 DHC01 的 7-DHC 产量高出近两倍。为了开始硫酸胆固醇的合成，团队进一步将人源羟基类固醇硫转移酶基因 SULT2B1b 整合到 CH01 菌株中，成功构建出初步产硫酸胆固醇的菌株 CHS01。该菌株生产了 36.6 mg/L的硫酸胆固醇，为后续优化奠定了基础。

硫酸胆固醇的合成需要以胆固醇为前体，而其关键代谢通路之一是甲羟戊酸（MVA）途径。为了提高胆固醇的产量，研究人员对MVA途径限速酶进行过表达优化，包括 ACS1、tHMG1（截短的 HMGR）、ERG20 和 IDI1。结果表明，过表达 tHMG1 使硫酸胆固醇的产量提高至 87 mg/L，比初始菌株 CHS01 提升了 1.4 倍。

接着，研究团队进一步整合了其他关键酶基因，如 ERG20、IDI1 和突变版的 ACS1（SeACS*）。然而，尽管这些基因的过表达增强了代谢流，但未能显著提高 CS 的产量。这说明，CS 的合成可能受限于辅因子 3'- 磷酸腺苷 -5'- 磷酸硫酸根（PAPS）的供应。

为了增加 PAPS 的供应，研究团队采用了多种策略，包括敲除内源 PAPS 还原酶基因（Δmet16），以减少 PAPS 的消耗，同时过表达合成PAPS的关键酶（如 MET3 和 MET14）等。实验显示，这些组合策略增强 CS 合成辅因子 PAPS 供应，显著提升了 CS 的产量，最佳菌株 CHS0502 的产量达到了 157 mg/L，较初始菌株 CHS04提高了 85%。此外，PAPS 的充足供应还提高了产物的硫酸化程度，进一步优化了 CS 的生成效率。

为进一步提高产量，团队关注到代谢途径中的关键节点，如脂质代谢和内质网（ER）的扩展。他们通过过表达磷脂合成相关的转录因子 INO4，成功扩大了内质网，使最佳菌株 CHS0505 的 CS 产量提升至 249 mg/L，比其前代菌株提高了 58.6%。

经过一系列代谢工程优化后，最佳菌株 CHS0505 在摇瓶培养中达到了 249 mg/L的硫酸胆固醇产量。然而，为实现更高效率，研究团队进一步在5 L 发酵罐中进行了补料分批发酵实验。

他们采用限碳策略，通过动态控制甘油的浓度，将其维持在 0.1–5 g/L 之间，确保代谢路径稳定运行。结果显示，菌株在 63.5 小时内实现了硫酸胆固醇的最大产量 545 mg/L，与此同时，总类固醇（包括7-脱氢胆固醇、胆固醇和硫酸胆固醇）的产量也达到了 621 mg/L。这一成果不仅是现有方法的重大提升，也标志着毕赤酵母作为高效细胞工厂的巨大潜力。

与传统化学转化法不同，这种基于微生物的生产体系通过简单碳源（如葡萄糖或甘油）合成硫酸胆固醇，不仅成本更低，而且显著减少了对环境的影响。这项研究展示了微生物细胞工厂在绿色工业生产中的巨大潜力，除了硫酸胆固醇，该还可以直接应用于微生物生产其他硫酸化天然化合物，如硫酸软骨素、硫酸肝素、苯硫代葡萄糖苷、大叶藻素酸、硫酸酪氨酸和硫酸柚皮素等。

Feng X, Dongfang L, Yingjia P, et al. Establishing Komagataella phaffii as a Cell Factory for Efficient Production of Cholesterol Sulfate[J]. ACS Sustainable Chemistry & Engineering, 2024, DOI: 10.1021/acssuschemeng.4c06112.

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