疫苗前沿 | mRNA疫苗的序列设计

导读：mRNA是一种新型的疫苗技术，mRNA的制备、质量检测和活性评估手段在近三年获得了飞速发展。

2024年5月，美国顶尖教学医院西奈山伊坎医学院Nicolas Vabret团队在Cell子刊STAR Protocols分享实验方法：Protocol for the development of mRNA lipid nanoparticle vaccines and analysis of immunization efficiency in mice。文章详细描述了mRNA疫苗的制备和体内外活性评估实验步骤，包含：mRNA序列设计、转录模板DNA制备、mRNA制备、mRNA-LNP包封、RNA质量检测和mRNA疫苗的免疫原性评估（体外细胞和体内小鼠试验）。

菌菌详细阅读了这篇文献，并将分期介绍给大家。本期文章菌菌将解读mRNA疫苗的序列设计部分。

01

mRNA关键元件的设计

研究人员描述了一种由脂质纳米颗粒（LNP）包封的mRNA疫苗，其mRNA序列包括5'非翻译区（5’ UTR）、编码序列（5种抗原和1个报告基因）、3’ UTR和多聚腺苷酸化（PolyA） 尾。此外，他们在5’ UTR的上游设计了一个腺嘌呤(A)核苷酸，以便于使用CleanCap AG帽类似物实现共转录加帽。

1.1 UTR序列设计

5’ UTR和3’ UTR序列对于mRNA的稳定性和翻译至关重要。在mRNA疫苗的设计过程中，5’ UTR和3’ UTR序列通常来自目标物种体内高表达基因的UTR，以促进有效翻译，如α-珠蛋白基因；或者通过指数富集（SELEX）的方式来实现 5’ UTR的系统演化。

例如，BNT162b2直接选取了人alpha珠蛋白基因的5’ UTR，同时针对Kozak序列进行了优化，具体为使用GCCACCAUG替换了ACCAUG。BNT162b2的3’ UTR由两个片段组成，分别来自人类线粒体12S rRNA（mtRNR1）和人AES/TLE5基因。

而Moderna基于SELEX方法全新设计了mRNA-1273的5’ UTR序列，序列中包括公认最优的Kozak序列GCCACCAUG。mRNA-1273采用了人源alpha珠蛋白的 3’UTR。

这篇文章中，研究人员在mRNA疫苗的序列设计中提供了以上两种示例的UTR序列，即来自BioNTech/辉瑞疫苗BNT162b2和Moderna疫苗mRNA-1273的UTR序列。

不同的5’UTR序列可能适用于不同的编码序列、不同的物种、不同的靶细胞。为此，耀海生物mRNA制备平台建立了丰富的天然UTR库、突变UTR库，为客户CDS序列定制化筛选最适合的UTR序列。如感兴趣可随时联系菌菌：133 8033 2910。

1.2 Poly(A)序列

Poly(A)尾巴同样促进mRNA的稳定性和翻译效率，poly(A)可以在DNA模板中编码或在体外转录（IVT）后添加。Poly(A)长度通常在120 nt左右，可以是纯腺苷（A）序列或者分段式序列。

在该Protocol中，作者采用了分段式尾巴，包括一个30个A、10个非纯A序列（GCATATGACT），最后是70个A。

耀海内部研究数据显示，使用DNA模板添加polyA可以更加精确地控制mRNA的长度。经过工艺优化，我们目前能够将polyA尾控制在目标长度±5 nt。

1.3 编码序列（CDS）

该mRNA疫苗的CDS区域由多个抗原编码序列串联组成，包括小鼠共享肿瘤相关抗原、肿瘤新抗原和源自卵清蛋白（OVA）抗原表位，抗原序列之间用10聚甘氨酸-丝氨酸（GS）接头连接。

在克隆到 mRNA 编码质粒之前，研究人员使用GENEWIZ生物信息学软件工具对抗原编码序列进行了密码子优化。

02

其他元件的设计

2.1 启动子序列

体外转录（IVT）是一种基于模板的过程，RNA聚合酶（RNAP）通过识别模板序列中的噬菌体启动子序列后，启动RNA转录本的生成。

可选的RNA聚合酶包括T7 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶，与之对应的，模板序列需具备T7启动子和SP6启动子。该Protocol中使用了最为广泛使用的T7启动子。

2.2 限制性酶切位点

为保证生成预期长度和序列的mRNA转录本，应考虑在质粒模板中设计独特的限制性内切酶位点，用于在mRNA编码序列的下游（即polyA/T下游）实现质粒DNA的线性化。

在这篇Protocol中，作者整合了一个IIS型限制性内切酶识别位点（BsPQI），该位点在polyA 尾的3'末端进行切割。

IIS型限制酶是理想的mRNA质粒模板线性化酶，这类酶可以在识别位点的下游特定距离处切割DNA双链，也就是说IIS型限制酶对切割位点的序列没有要求，有利于保证mRNA序列的完整性。

参考文献

[1] Karekar N, Reid Cahn A, Morla-Folch J, Saffon A, Ward RW, Ananthanarayanan A, Teunissen AJP, Bhardwaj N, Vabret N. Protocol for the development of mRNA lipid nanoparticle vaccines and analysis of immunization efficiency in mice. STAR Protoc. 2024 Jun 21;5(2):103087. doi: 10.1016/j.xpro.2024.103087.

[2] Brouze A, Krawczyk PS, Dziembowski A, Mroczek S. Measuring the tail: Methods for poly(A) tail profiling. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2023 Jan;14(1):e1737. doi: 10.1002/wrna.1737.

[3] RNA Methods and Protocols.

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撰写| 工程菌星球

校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea

编辑 设计| Alice