FSHW | 内质网应激改善鸡肉嫩度并促进细胞凋亡和自噬

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Introduction

肉类品质是影响消费者购买的重要指标，其中嫩度是决定肉类食用品质的最重要指标之一。动物组织中的肌肉在屠宰后会发生一系列理化性质的变化，主要包括僵直和成熟。肌肉通常储存在0～4 °C的温度下进行宰后成熟。宰后成熟有助于将不可食用的肌肉转化为可食用的肉类，是提高肉类嫩度的有效途径。屠宰后肉嫩度增加的主要原因是内源性蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解。细胞凋亡酶和钙蛋白酶是肌肉向食用肉转变过程中发挥作用的最主要水解酶类，可降解结构蛋白，最终造成肌细胞骨架的消失。

近年来，细胞凋亡理论在肉类成熟中的贡献受到了极大的关注。屠宰后，动物在很短的时间内几乎耗尽了所有的血液，在这种情况下，动物体内的肌细胞不可避免地处于缺氧和缺血状态，导致细胞凋亡和自噬。细胞凋亡是细胞接收到凋亡信号，在一系列凋亡酶和凋亡因子的协调作用下进行信号的传导并最终完成细胞的凋亡。但不同的凋亡诱导信号所形成的传导途径并不相同，目前发现的传导途径主要包括死亡受体途径、线粒体途径和内质网应激途径。线粒体作为能量代谢的重要细胞器，线粒体凋亡已被证明有利于肉的嫩化，Bcl-2家族在其中发挥着重要作用。Bcl-2家族通过促凋亡因子和抗凋亡因子的相互作用来控制细胞凋亡和存活。

内质网产生生物体所需的大部分蛋白质、甾醇和脂质，是一种重要的细胞器。当细胞受到持续的化学刺激、氧化应激或能量代谢失衡时，它们会发生一系列变化。内质网中蛋白质合成异常、钙稳态失衡和内质网功能障碍都会导致内质网应激。宰后缺氧和缺血会破坏内部环境的稳态，从而引起内质网应激。然而，内质网应激是否在宰后成熟过程中对肉的嫩化起作用尚不清楚。自噬也被称为II型程序性细胞死亡。自噬是一种重要的细胞内代谢途径，错误折叠的蛋白质和受损的细胞器从细胞质中分离出来形成自噬体，并转移到溶酶体中进行降解。西班牙科学家在早期宰后牛肉中发现了自噬现象。然而，很少有研究涉及宰后肉类嫩化过程中的内质网应激，以及内质网应激介导的细胞凋亡和自噬对肉质的影响。

西北农林科技大学柴雨薇硕士，陈琳教授和冯宪超教授等 研究了内质网应激对宰后成熟过程中鸡肉嫩度以及细胞凋亡和自噬的影响。本研究通过内质网应激诱导剂衣霉素（TM）和抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）在宰后鸡肉中建立内质网应激模型，探究了宰后鸡肉嫩度、肌原纤维结构和内源酶的变化情况，并进一步研究了内质网应激对宰后成熟过程中细胞凋亡和自噬通路的影响，从内质网应激的角度阐述肉类成熟的机制，为肉类嫩度品质的调控提供了新的思路与见解。

Results and Discussion

TM和4-PBA在宰后成熟期间有效建立内质网应激模型

与对照组相比，TM处理使宰后鸡肉中内质网应激相关因子BiP、XBP1、IRE1和CHOP条带的表达增强（图1A-E），而4-PBA处理后降低了BiP、XBP1、IRE1和CHOP的表达（图1F-J），表明TM激活了IRE1信号通路，诱导了鸡肉宰后成熟过程中的内质网应激，而4-PBA抑制了内质网应激。

内质网应激改善宰后成熟过程中鸡肉嫩度

肉的嫩度通常通过剪切力和肌原纤维断裂指数（MFI）来评定。剪切力随着宰后成熟时间的增加而逐渐减小（图2A、B）。TM处理后第1天和第3天的鸡肉剪切力极显著低于对照组（图2A），而4-PBA处理在第1天和第3天显著增加了鸡肉的剪切力（图2B）。与对照组相比，TM处理显著增加了MFI值，第1天和第3天之间差异极为显著（图2C），而4-PBA降低了MFI（图2D）。这些结果表明，内质网应激对改善鸡肉宰后成熟过程中的嫩度具有积极作用。

内质网应激促进宰后成熟过程中肌原纤维降解

通过TEM进一步观察肌原纤维纵切面的微观结构。对照组的I带出现轻微断裂（图3A-C），而TM处理后的I带断裂十分严重（图3G-I）。在对照组中，M线的轻微降解从第3天开始（图3B），并发生在4-PBA处理的第5天（图3F），而这种现象在TM处理的第1天即可观察到，且A带和I带之间的界限开始模糊（图3G）。在TM处理的第5天，M线和A带几乎完全消失，I带严重崩解，肌原纤维骨架几乎完全解体，相邻肌原纤维的连接也存在断裂，Z线相对变得模糊和扭曲（图3I）。与对照组相比，4-PBA处理后，除第5天M线降解外，肌原纤维结构相对完整，A带和I带边界显著，Z线清晰完整（图3D-F）。这些结果表明，TM诱导的内质网应激对肌原纤维有很大影响，通过破坏主要结构导致肌原纤维崩解，相反，4-PBA则减弱了肌原纤维的降解，对肌原纤维结构起到保护作用。

内质网应激促进宰后成熟过程中desmin和内源酶降解

Desmin参与了肌节结构的早期建立，其降解是成熟过程中最早的标志物之一，被认为是肉类嫩化的关键。与对照组相比，TM处理组在第1天和第5天的desmin条带强度极显著降低（图4A、B），4-PBA处理能极显著地增加desmin的表达（图4A、C）。

μ-Calpain是宰后成熟过程中最重要的内源性酶，TM诱导内质网应激后，μ-calpain的80 kDa条带的强度在第1天和第3天显著降低（图4D、F），在4-PBA处理后表达极显著增加（图4G、I）。Caspase-12还是内质网应激的特异性凋亡因子。TM处理后pro-caspase-12第1天和第5天的表达显著低于对照组（图4D、E），而在4-PBA处理组中显著高于对照组（图4G、H）。内质网应激对肌原纤维的破坏，可能是μ-calpain和caspase-12共同作用的结果，并与内质网应激引起的细胞凋亡有关。

内质网应激促进宰后成熟过程中细胞凋亡

Bcl-2家族在线粒体凋亡途径中发挥着重要作用。在TM诱导内质网应激后，Bcl-2家族抗凋亡因子Bcl-xL蛋白和mRNA的表达降低（图5A、D、F），而促凋亡因子Bax蛋白强度显著增强（图5A、B），Bim蛋白强度在第3天和第5天极显著增加（图5C）。cyto-c mRNA的表达在TM处理的第1天和第三天显著增加（图5E），表明线粒体膜通透性受到影响。相反，4-PBA处理组Bcl-xL蛋白和mRNA的表达在第3天和第5天显著增加（图5G、J、L），Bax和Bim蛋白的强度低于对照组，cyto-c mRNA的表达在第1天和第5天显著下降（图5K）。内质网应激可能通过激活CHOP和IRE1来调节Bcl-2家族，从而在宰后成熟过程中释放cyto-c激活线粒体凋亡途径。

内质网应激促进宰后成熟过程中细胞自噬

TM处理后，LC3II/LC3Ⅰ的表达趋于增加（图6E），而4-PBA处理组抑制LC3I向LC3II的转变（图6J）。与对照组相比，TM处理后Beclin-1蛋白表达的增加极为显著（图6A、B），而4-PBA处理后第3天和第5天Beclin-1条带的强度显著降低（图6G、H）。p62是自噬的负调节因子。TM处理后p62蛋白表达减少（图6A、D），而4-PBA处理后极显著增加（图6G、I）。这些结果表明自噬被内质网应激激活。此外，TM处理后，PI3K的表达显著低于对照组（图6F），mTOR表达显著降低（图6A，C），而4-PBA处理后相反，内质网应激调节的自噬可能与mTOR有关。

Conclusion

内质网应激通过激活内源性酶（caspase-12和μ-calpain），降解肌原纤维蛋白，破坏肌原纤维结构，从而降低剪切力，表明内质网应激在肉的成熟嫩化中发挥了积极作用，有效提高了肉的嫩度。此外，内质网应激能够通过调节Bcl-2家族来激活细胞凋亡，并促进自噬。

第一作者

柴雨薇，女，硕士。于2023年获西北农林科技大学食品工程硕士学位。主要从事肉品品质调控等相关研究。以第二作者身份在LWT- Food Science and Technology发表SCI论文1篇。

通信作者

陈琳，现为西北农林科技大学食品营养系教授。主要围绕畜产品营养与质量控制，肉品科学，动物性蛋白结构与功能展开研究工作。主持国家自然基金3项，国家博士后项目2项等省部级以上项目10余项；以第一或通讯作者发表SCI源论文20余篇。

冯宪超，现为中国畜产品加工研究会青年委员会委员，陕西省家兔现代产业技术体系岗位专家，西北农林科技大学肉品加工研究团队负责人。主要围绕动物源食品加工与质量控制、食品蛋白质结构与功能展开研究工作。主持国家自然基金4项；以第一或通信作者发表SCI源论文33篇；获得陕西省高等学校科学技术一等奖、二等奖各1项（排名均第一）。

Endoplasmic reticulum stress improved chicken tenderness, promoted apoptosis and autophagy during postmortem ageing

Yuwei Chaia, Lin Chena,*, Shuya Xianga, Linxuan Wua, Xuebo Liua, Jun Luob, Xianchao Fenga,*

a College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China

b College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China

*Corresponding author.

Abstract

In this study, endoplasmic reticulum (ER) stress inducer tunicamycin (TM) and inhibitor 4-phenylbutyric acid (4-PBA) were used to treat postmortem chicken breast muscle to investigate changes in tenderness and effects on apoptosis and autophagy during 5 days ageing. TM-induced ER stress reduced shear force, enhanced myofibril fragmentation index (MFI), disrupted myofibril structure, increased desmin degradation, and activated μ-calpain and caspase-12. In addition, TM-induced ER stress increased the expression of Bax, Bim, and cytochrome c, and decreased the expression of Bcl-xL. Furthermore, TM-induced ER stress improved the conversion of LC3I to LC3II, raised the expression of Beclin-1, and decreased the expression of p62, PI3K, and mTOR. The opposite results were observed after 4-PBA treatment. These results suggested that ER stress could improve chicken tenderness, promote apoptosis and autophagy during chicken postmortem ageing.

Reference:

CHAI Y W, CHEN L, XIANG S Y, et al. Endoplasmic reticulum stress improved chicken tenderness, promoted apoptosis and autophagy during postmortem ageing[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(4): 2141-2151. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250178.

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编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片来源：图虫创意