中药单体靶点筛选新技术 | Phytomed揭示雷公藤红素靶向YY1和HMCES诱导DNA损伤和细胞死亡

2024年8月8日，暨南大学中医药学院的杨钦河教授以及中国中医科学院王继刚教授和南方科技大学戴凌云教授联合在Phytomedicine在线发表了题为“Celastrol induces DNA damage and cell death in BCR-ABL T315I-mutant CML by targeting YY1 and HMCES”的文章。除了通过靶向 HSP90 引起未折叠蛋白反应之外，雷公藤红素还可以通过靶向 YY1 和 HMCES 蛋白影响 DNA 损伤反应过程，从而导致 DNA 损伤的积累，最终导致细胞死亡。

摘要

通过转录组学和蛋白质组学分析系统地研究雷公藤红素在K562T315I细胞中的分子MoA。为了鉴定雷公藤红素的靶蛋白，我们进行了质谱耦联细胞热位移实验(MS-CETSA)，然后通过基因敲低和过表达、细胞增殖实验、彗星实验、Western blot、雷公藤红素探针原位标记和下拉实验、分子对接和生物层干涉实验进行了验证。多组学分析表明，雷公藤红素主要诱导K562T315I细胞的DNA损伤积累和未折叠蛋白反应。在12个最具潜力的雷公藤红素靶点中，实验证据表明，雷公藤红素与YY1和HMCES的直接相互作用会增加DNA损伤水平，导致细胞死亡。本研究首次利用全蛋白质组非标记靶点去卷积方法MS-CETSA鉴定雷公藤红素的蛋白质靶点。本研究还开发了一种新的系统药理学策略。这些发现为雷公藤红素的多层面机制提供了新的认识，更重要的是，强调了DNA损伤和修复通路中的靶向蛋白，特别是YY1和HMCES，在对抗耐药性CML方面的潜力。

1.网络药理学分析显示，雷公藤红素是一种有前景的CML抑制剂

首先进行了网络药理学分析，以评估治疗CML的最有效天然产物。通过统计计算药物-靶点相互作用网络和cml相关基因/蛋白质网络之间的重叠，确定了效力最强的化合物。根据针对3,882种天然产物的38,220种复合蛋白相互作用(CPIs)网络，确定了338种可能对CML具有强效抑制活性的天然产物。根据化合物的MACCS指纹图谱进行层次聚类分析，得到8个明显的聚类。3个最大的聚类主要由萜类、生物碱和类黄酮组成。评分超过20分的天然产物的特性。雷公藤红素(Celastrol)和雷公藤内酯醇(triptolide)，都来自“雷公藤”，被确定为簇1中最显著的化合物，簇1是最大的一个簇(属于萜类化学类)。

为了验证网络药理学筛选的可靠性，首先在CML细胞中进行了细胞活力测定。选择了18β-甘草次酸作为阴性对照分子，18β-甘草次酸与雷公藤红素的结构最相似，但在3882种天然产物中作为阴性对照分子的预测评分不高(图1a)。由于HSP90是雷公藤红素的假定靶点，因此还纳入了强效HSP90抑制剂17-AAG和第一种TKI药物伊马替尼作为两个阳性对照分子(图1a)。用这些分子处理CML细胞株K562和KBM7，结果显示雷公藤红素、17-AAG和伊马替尼在不同有效浓度下均能有效抑制CML细胞增殖，阴性对照分子18β-甘草次酸几乎不像预期那样影响细胞生长(图1b, c)。

使用基于CRISPR/Cas9的碱基编辑技术，在K562细胞中特异性地引入BCR-ABL基因上的ACT到ATT(编码T315到I315)突变，从而产生了K562T315I细胞系(图1D)。K562T315I细胞的成功构建首先通过DNA测序进行验证，然后通过其对伊马替尼的耐药性进行验证，与K562野生型相比，突变细胞系表现出30.12的耐药指数，在K562和K562T315I中，IC50分别为102.7 nM (95% CI: 90.0-116.7 nM)和3092.9 nM (95% CI: 2008.0-4908.7 nM)(图1e)。有趣的是，雷公藤红素对K562和K562T315I细胞均显示出相当的抗增殖活性，IC50值分别为227.2 nM (95% CI: 201.0-251.5 nM)和259.1 nM (95% CI: 235.5-283.4 nM)(图1f)。基于Annexin V-FITC/ pi的凋亡实验也显示，伊马替尼对K562T315I细胞的杀伤作用显著减弱，而雷公藤红素在K562和K562T315I细胞中诱导的凋亡细胞死亡相当(图1g)。这些结果表明雷公藤红素可能独立于BCR-ABL或其激活状态发挥作用。

图1 雷公藤红素作为CML细胞的抑制剂

2.雷公藤红素对蛋白质丰度和溶解度的调节

接下来，还进行了基于质谱的蛋白质组学研究，以研究雷公藤红素对K562T315I细胞中蛋白质表达水平的调节(图2a)。在8316个定量蛋白中，ANOVA检验发现了304个不同组之间的差异表达蛋白(DEPs)。通过表达模式的k-means聚类，这些dep被分为6个簇(C1-C6)(图2b)。随着雷公藤红素浓度的增加，簇C1和C2的蛋白表达呈下降趋势，而簇C4和C5呈上升趋势(图2b)。特别是C2和C5簇中的DEPs对低剂量雷公藤红素的反应更为敏感，这表明它们很可能是早期反应者或紧邻直接靶点的邻近区域。随后对这些DEPs的功能富集分析表明，C2 DEPs主要富集于DNA和RNA代谢通路以及DNA损伤应答，而C5 DEPs主要参与蛋白质加工通路(图2b)。对C2和C5 DEPs的进一步MCODE分析显示，“对DNA损伤刺激的反应”和“对未折叠蛋白的反应”分别是最特征性的通路(图2C, D)。注意到雷公藤红素与其假定的靶点HSP90的相互作用可能是“对未折叠蛋白的反应”上调的关键贡献事件。据我们所知，没有雷公藤红素的直接蛋白靶点被报道与“对DNA损伤刺激的反应”通路相关。

图2 雷公藤红素处理后K562T315I细胞的定量蛋白质组学分析

除了对总蛋白的经典表达蛋白质组学，还进行了蛋白质组积分溶解度改变(PISA)分析，这是一种简化的CETSA，在乙状熔解曲线下测量所有样本温度点下剩余蛋白的总数，以检测雷公藤红素处理K562T315I细胞后可溶性蛋白水平的变化。简单地说，收集了雷公藤红素或dmso处理的细胞，在46℃到60℃的不同温度下进行热处理，提取可溶性蛋白部分，并将它们组合起来进行质谱定量(图3A)。通过比较不同条件下可溶性蛋白积分量的差异，PISA分析提供了一种量化不同细胞状态下蛋白质相互作用状态(PRINTS)调制程度的简化方法(图3b)。在雷公藤红素处理后鉴定了178个差异溶解蛋白(DSPs)(图3c)。经过层次聚类后，C2和C4簇中的DSP蛋白呈现出明显的浓度相关趋势(图3c, d)。C2 DSPs的溶解度随着雷公藤红素浓度的增加而增加，主要位于DNA中心区域，包括细胞核和线粒体，更具体地说位于DNA损伤位点(图3e)。相反，“伴侣分子复合物”中的C4 DEPs溶解度降低(图3e)，这可能是由于雷公藤红素和HSP90之间的相互作用。

图3 对雷公藤红素处理后K562T315I细胞中可溶性蛋白进行定量蛋白质组学分析

4.雷公藤红素诱导K562T315I细胞DNA损伤

系统分析雷公藤红素处理K562T315I细胞后总蛋白和可溶性蛋白水平的变化表明，雷公藤红素主要诱导K562T315I细胞的DNA损伤和未折叠蛋白反应。因此，进行了实验来验证这些观察结果。事实上，雷公藤红素显著诱导DNA损伤的常见标志物γ-H2AX的表达，并降低DNA损伤修复相关蛋白FANCD2的水平(图4a)。HSP90的表达水平也呈上升趋势。彗星实验进一步证实了雷公藤红素引起的DNA损伤(图4b)。

图4 雷公藤红素诱导CML细胞的DNA损伤

5.雷公藤红素在K562T315I细胞中的靶点鉴定

然后，在细胞裂解物中进行了质谱耦合等温剂量响应-细胞热位移分析(MS-ITDR-CETSA)实验，以确定雷红素的直接蛋白靶点，特别是与DNA损伤应答相关的蛋白靶点。在检测到的3393个蛋白中，有12个蛋白的热稳定性发生了显著变化，代表了最具潜力且可信度高的靶蛋白(图5a、b)。注意到，雷公藤红素的已知靶点HSP90 (HSP90AA1和HSP90AB1)仅表现出热稳定性的微小变化，未通过阈值。对这12个潜在靶点和定量蛋白质组学分析的C2 DEPs进行蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析，主要富集在“对DNA损伤刺激的反应”中，发现阴阳1 (YY1)是连接最强的靶点(图5c)。同样地，对这12个潜在靶点与PISA中的C2 DSPs(富集在“DNA损伤位点”)的PPI分析显示，YY1仍然是连接最多的蛋白(图5d)。因此，YY1与所有这些DEPs/DSPs的关联节点数量最多，可能是与DNA损伤相关的最重要的靶点(图5e)。现有的研究表明，YY1作为一种转录因子，可以调节参与DNA修复和DNA损伤后细胞存活的各种蛋白的表达。此外，HMCES已被确定为通过屏蔽基础位点来保护基因组完整性免受氧化碱损伤的关键蛋白。

因此，继续通过Western blot-coupled cellular thermal shift assay (WB-CETSA)验证雷公藤红素与YY1和HMCES的相互作用。在与雷公藤红素的相互作用下，YY1和HMCES的热稳定性都显著增加(图5f)。同样，报道的阳性对照HSP90蛋白也显示出明显的热稳定性增加(图5f)。

图5 MS-ITDR-CETSA实验鉴定雷公藤红素在K562T315I细胞中的直接结合靶点

6.验证雷公藤红素与YY1和HMCES的相互作用

为了进一步验证雷公藤红素与YY1和HMCES的直接相互作用，使用了一种带有可点击炔标签的雷公藤红素探针(Cel-P)(图6a和b)。探针保留了雷公藤红素对K562T315I细胞的抑制活性(图6c)，雷公藤红素能够有效地与Cel-P在原位标记靶蛋白(图6D)。然后进行了pull-down实验，随后进行了Western blot检测，证明Cel-P能够成功地从细胞中拉下HMCES和HSP90蛋白(图6e)。由于WB-CETSA结果表明雷公藤红素和YY1之间存在潜在的相互作用(图5f)。rYY1的标记随着Cel-P浓度的增加呈剂量依赖性增加(图6f)。此外，当过量的雷公藤红素与固定浓度的Cel-P共孵育时，发现标记减少，表明有效竞争(图6f)。

图6 利用雷公藤红素探针(Cel-P)验证雷公藤红素与YY1和HMCES的相互作用

7.雷公藤红素通过靶向YY1和HMCES诱导DNA损伤

在验证了雷公藤红素与YY1和HMCES之间的相互作用后，继续在K562T315I细胞中敲低YY1或HMCES。细胞增殖实验表明，敲低YY1或HMCES显著增加了DNA损伤的发生，表现为γ-H2AX基线水平的增加，同时影响了细胞生长(图7a - d)。此外，还评估了不同细胞对雷公藤红素处理的敏感性。敲低YY1或HMCES后，细胞对雷公藤红素的敏感性显著增加(图7e, f)。随后的WB分析也显示，与shNC对照相比，YY1或HMCES敲低的细胞中γ-H2AX的表达水平显著升高(图7g, h)。与HMCES相比，YY1的敲低对细胞的影响更深刻，表明YY1在细胞中发挥更重要的作用。

对接分析显示，雷公藤红素对YY1的亲和力为−8.563±0.027 kcal/mol(预测结合值pKi为0.52±0.02µM)，而HMCES对YY1的亲和力为−7.991±0.091 kcal/mol(预测结合值pKi为1.38±0.20µM)，雷公藤红素对YY1的亲和力略强。雷公藤红素与YY1上的Leu132和Val316形成氢键，并与Thr6, Tyr8, Ile131, Leu132和Val324进行疏水相互作用(图7i)。雷公藤红素与HMCES的相互作用包括与Glu127、Arg130、Arg137形成氢键，与Trp128、Arg137形成疏水作用，与His210形成盐桥(图7j)。

图7 雷公藤红素通过靶向YY1和HMCES诱导CML细胞DNA损伤积累并抑制其增殖

8 YY1在雷公藤红素诱导的K562T315I细胞DNA损伤和细胞死亡中起关键作用

鉴于YY1在雷公藤红素诱导的DNA损伤反应中明显的关键作用，我们进一步对YY1蛋白进行了实验以证实我们的发现。首先，YY1在K562T315I细胞中过表达(图S9A)。虽然过表达YY1并没有明显影响细胞生长，但确实减轻了雷公藤红素引起的细胞死亡和DNA损伤(图S9B-D)。Western blot分析也表明YY1的表达与雷公藤红素诱导的细胞凋亡呈负相关，PARP1和Caspase-3的裂解水平也证明了这一点(图8a和b)。由于YY1是一个重要的转录因子，我们还使用双荧光素酶报告基因检测了雷公藤红素处理后YY1的转录活性。结果表明雷公藤红素显著抑制YY1的转录活性(图8c)。最后，通过生物膜干涉(BLI)结合实验研究rYY1与雷公藤红素的相互作用。如图8d所示，雷公藤红素可与rYY1结合，解离常数(KD)值为2.19 μM。

图8 YY1在雷公藤红素诱导的K562T315I细胞DNA损伤和细胞死亡中起关键作用

结论

在这项研究中，使用多组学方法对雷公藤红素的MoA进行了系统的研究。这项研究也代表了第一个利用全蛋白质组非标记的靶点去卷积方法，MS-CETSA，来鉴定雷公藤红素的蛋白质靶点。不仅验证了雷公藤红素通过靶向HSP90诱导未折叠蛋白反应，还发现在耐药的K562T315I CML细胞中，雷公藤红素通过直接靶向YY1和HMCES诱导DNA损伤。研究有助于更好地理解雷公藤红素的多层面作用机制。更重要的是，本研究为靶向CML和其他癌症，尤其是耐药癌症的DNA损伤通路提供了重要的理论支持。最后，我们提供了一个有效的系统药理学工作流程范式，该工作流集成了网络药理学分析，蛋白质丰度和溶解度测量，以及MS-CETSA来解开任何天然产物或活性化合物的MoA。这种系统药理学策略通过阐明与功能蛋白靶点的相互作用关系，为生物活性分子的药理学和毒理学基础提供了更全面的视角。

Yang F, Zhou H, Luo P, Jia L, Hou M, Huang J, Gao L, Zhang Q, Guan Y, Bao H, Zhang B, Liu L, Zou C, Yang Q, Wang J, Dai L. Celastrol induces DNA damage and cell death in BCR-ABL T315I-mutant CML by targeting YY1 and HMCES. Phytomedicine. 2024 Aug 8;134:155937. doi: 10.1016/j.phymed.2024.155937.

本推文转自：天然产物靶点发现；侵删！

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