脑声问答（98）期丨大鼠新物体识别实验方法与测试标准

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物体识别实验(Object recognition task，ORT)是一种利用啮齿类动物天生喜欢接近和探索新奇物体的本能来检测动物识别记忆的精细、敏感的行为学方法。标准的物体识别实验检测的是啮齿类动物的自发行为，并且ORT周期较短，避免了长时间训练可能导致的对动物的影响、动物体力消耗小、动物几乎无中途脱失及死亡，进入结果分析的数据较全面，自被提出后就引起了国际科学界的极大兴趣，广泛用于记忆神经生物学研究、脑损伤机制研究以及认知障碍防护措施研究等多个方面。

大鼠物体识别实验程序

大鼠物体识别实验的基本程序主要有3个阶段组成:适应期、熟悉期和测试期。适应期时将大鼠依次放入没有任何物体的实验装置中，使其自由探索以便适应进行实验的环境，尽量减少动物进行实验时的应激性。熟悉期时在实验装置底板的相邻或相对位置放入两个完全相同的物体(A1和A2)，将大鼠以背对两个物体的方式放入实验装置中，一定时间后将动物取出放回动物饲养笼中。间隔相应时间后，进行测试期实验。测试期和熟悉期过程类似，只是将两个完全相同的物体中的一个换成另一个不同物体，相对于熟悉期的两个物体测试期时的物体分别被称为熟悉物体(A3)和新奇物体(B)。在测试期实验时，为了防止实验动物对某个物体或某个位置特别偏爱导致实验误差出现的现象，大鼠依次进行实验时熟悉物体和新奇物体的功能及位置要相互交换。此外，为了排除气味的影响，物体和实验箱体要及时清洗。

物体识别实验中最基本的指标是动物在熟悉期和测试期对两个物体的探索时间(s)。实验动物对新奇物体的偏爱可以用“辨别指数”这一指标进行量化，“辨别指数”一般用D2(d2)表示，是由测试期实验时动物对新奇物体的探索时间和对熟悉物体的探索时间计算得到的，具体的计算公式是:D2=(N-F)/(N+F)，“N”表示测试期时动物对新奇物体的探索时间，“F”表示测试期时动物对熟悉物体的探索时间，“辨别指数”考虑到了动物之间不同的探索活动水平。

优势

物体识别实验是一种精细、敏感的行为学检测方法，以其独特的优势常被用于研究哺乳类动物识别记忆相关脑功能区及分子机制、脑组织损伤研究。通过物体识别方法作者了解到大鼠内侧颞叶脑区对物体识别记忆功能的发挥起到非常重要的调节作用，而边缘皮层、海马、杏仁核等是起关键作用的相关组织。物体识别被广泛应用的另一个领域是对认知功能障碍及其防护措施等方面的研究。临床上常见的一些疾病，例如，老年性痴呆、阿次海默病、亨廷顿病及精神分裂症等，在疾病发生、发展的过程中会出现一定的认知功能障碍，严重影响了病人的生活质量。物体识别常以相关的动物模型为基础，对疾病的病因及防治措施进行临床前研究。这些研究包括对老年大鼠识别记忆功能障碍的研究、对精神分裂症识别记忆障碍机制的研究、对亨廷顿病识别记忆障碍的研究等，并且物体识别实验在药物筛选、药物作用机制及药物毒性评价方面具有独特优势。许多研究者在利用物体识别进行上述相关领域研究的过程中，根据各自研究的目的对具体的实验方法进行了或多或少的改变，但是基本的程序仍然包括适应、熟悉和测试三个时期，只是每个时期的持续天数、次数和每个时期每次持续时间不同而已。

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涉及大鼠物体识别实验的研究中，熟悉期和测试期通常是持续1d，而适应期持续的天数和每天的次数则不定。适应期的主要目的是让动物适应进行实验的环境，减少熟悉期和测试期时动物因新环境影响对物体的探索进而影响实验结果。熟悉期和测试期每次的实验时间3～5min最为常用，两个阶段实验时间的选择存在一定的理论依据，熟悉期的主要目的就是引入“熟悉物体”，熟悉期实验时间或熟悉期时动物对物体探索时间的长短可能会影响测试期时动物对“新奇物体”和“熟悉物体”的辨别能力。有研究表明当大鼠对实验环境足够适应并且熟悉期时间为2min时，在测试期大鼠不能够表现出对“新奇物体”的偏爱，而相同条件下时间为3min时，大鼠对“新奇物体”的探索明显增多。测试期是检测动物记忆能力的主要阶段，动物凭借对“新奇物体”的偏爱性，对先后出现的两个不同物体探索时间会有所不同，但有研究表明动物的这种“新奇偏爱性”有一定的时间限度，随着时间的推移最初的“新奇物体”可能不在具有新奇性，反而会更偏爱“熟悉物体”。因此，为确保实验结果的可靠性，测试期时间的选择要合理。研究动物对不同物体“新奇偏爱性”的持续时间，找到“新奇物体”转变为“熟悉物体”的临界点或许对测试期时间的选择有所帮助，人们从不同角度对这一阶段时间的确定进行了研究，通过记录测试期前1min内、2min内和3min内动物对物体的探索时间发现动物对物体的探索主要集中在实验开始的最初几分钟内，对测试期时间的确定提供了参考。

物体识别实验中涉及到的其他相关时间就是熟悉期和测试期之间的时间间隔(Delay)。物体识别实验多用于检测动物的短期记忆，熟悉期和测试期之间的时间间隔可以是几秒钟、几分钟或几个小时等，多根据各自的研究目的进行选择。对涉及大鼠物体识别实验的相关研究中所用时间间隔进行部分列举:10s;1min;10min;15min;1h;3h;4h;24h;48h。大鼠对“熟悉物体”的记忆随着时间间隔的增长逐渐变弱，当大鼠物体识别实验流程为“一次性”(one-trial)的最初程序时，一般认为当时间间隔为24h测试期时，大鼠已经不能辨别出两个不同物体，而当时间间隔较短时，动物会表现出较好的辨别能力，例如，通常Wistar大鼠在时间间隔为1h时表现出较好的辨别能力。熟悉期和测试期间的时间间隔长短直接影响测试期的检测结果，同时也是用此方法进行相关药效学实验时要考虑的内容。当用大鼠作为实验动物时，一般选24h作为时间间隔对改善识别记忆的潜在药物进行筛选，而选1h作为检测药物记忆损伤作用的时间间隔。

大鼠对物体进行探索的标准

动物对物体的探索时间是物体识别实验过程中记录的主要指标，正确判断动物对物体的探索活动是进行物体识别实验的前提。目前，物体识别实验多数还是通过人工观察并用秒表记录动物对物体的探索时间，在不同研究中实验人员对探索标准的规定有所不同。Ennaceur和Delacour对大鼠的探索活动规定为:大鼠鼻子在≤2cm范围内直指向物体或直接接触物体时进行的行为活动，而当大鼠转头或坐在物体上时不被认为是对物体进行的探索活动。目前，大部分涉及物体识别实验的研究仍然采用人为观察、手工计时的方式进行，不同的研究对“探索”的定义会有所不同。在涉及大鼠物体识别实验的大部分文献中对“探索”的定义与Ennaceur和Delacour研究中的定义类似，主要是观察大鼠头部特别是口鼻处对物体的行为活动，这些行为活动包括嗅、舔或触须感触等，当大鼠坐在物体上或口鼻部没有直指向物体时不被认为是对物体的探索活动，有差别的地方主要是口鼻部到物体的距离。为准确的判断动物对物体的探索活动，在定义探索标准时通常要设定相关的参数，“距离”是最常见的参数，一般规定在1～4cm的范围内;有些文献中在设定“距离”参数的同时，还设定“角度”参数，单独设定“角度”参数的很少见。但是也有些研究中没有设定参数，认为只有大鼠口鼻部直接接触到物体进行的行为活动才是探索活动并对这些活动进行了说明。

影响因素

ORT和其他行为学检测方法一样，都发生在一定的实验装置中。进行大鼠物体识别实验的装置不是固定的，不同文献中所用装置可能在材料、尺寸、形状和颜色等方面存在差异。进行物体识别实验装置的形状以开口的矩形和方形常见，少数研究中使用圆形装置。

实验装置的形状、尺寸和材料等都可能对物体识别实验的结果产生影响，在进行实验时要选择合适的实验装置。有研究表明，矩形或方形装置的四个角会使大鼠停留不动的机会增多，从而影响了大鼠物体的探索活动，导致测试期时大鼠不能正确的辨别出“新奇物体”和“熟悉物体”，而当检测装置为圆形时大鼠能够表现出较正常的辨别记忆能力，为避免这些问题，近来有人专门对装置进行了研究。另外，在选择物体识别实验装置时要综合考虑研究的目的和实验动物的体征。进行物体识别实验的装置，除了表2列举的部分外，有的研究中还用圆形轨道、迷宫作为大鼠物体识别实验的装置。

进行物体识别实验除了要提供合适的实验装置外，还要选择“新奇物体”和“熟悉物体”。对于物体的选择没有固定的要求，不同研究所用物体在形状、颜色、尺寸等多个方面会有所不同，这些物体可能是不同类型的瓶子、罐头盒、玻璃杯、凌锥、烛台、圆柱、玩具、管子等等。由于物体识别实验基于啮齿类动物天生喜欢接近和探索新奇物体的本性，理论上只要先后出现的两个物体有所不同动物就能够进行区别，多数文献对物体的特点没有特别要求，只对物体所用材料、尺寸、数量等进行描述。但在有些研究中要求所有物体的材料要相同，以避免大鼠从材料的气味进行辨别，有些会要求物体材料对大鼠没有特殊的吸引性(导致探索异常增强);在个别文献中会检测“熟悉物体”和“新奇物体”对大鼠的吸引程度是否相同，来杜绝大鼠对某一物体极端偏爱而影响实验结果的现象。对于物体的材料，还要考虑是否不易被动物损坏并且容易清洗等问题。另外，在一些文献中会对物体的尺寸有所要求，主要是对物体尺寸与大鼠的体长的关系进行说明。

在实验过程中，为避免动物对某一物体特别偏爱或对某一位置偏爱，物体的功能和位置要相互平衡，以便减少实验误差。物体在实验装置中的位置，一般是两个物体相邻或相对距离装置侧壁一定的距离或紧靠侧壁。

Table1大鼠物体识别实验所用实验装置

物体识别记忆的种类繁多，现已证实，啮齿类动物能够区别出不同于熟悉物体的新物体(物体识别，Object recognition task)，用于检测动物的非空间记忆能力;能够分辨出熟悉物体先前及现在的位置(物体的位置识别，Object-place recognition task)，用于检测动物的空间记忆能力;可以分辨出物体所在的背景信息(物体情景识别，Object-context recognition task);可以分辨出物体出现的顺序(时序记忆，Temporal order memory task)等。与延迟(非)匹配实验和各种迷宫等学习记忆任务相比，物体识别实验不需要大量的预训练，不需要水和食物的限制或剥夺，不需要强化刺激(如食物或电击)的应用，不需要对实验设计的规则进行学习、保持并应用，不需要建立奖赏反馈的机制。因此，相对于其他记忆任务，物体识别记忆具有许多优势。

文献引用

• Object recognition testing: Rodent species, strains, housing conditions, and estrous cycle[J]. Nick P. van Goethem;;Kris Rutten;;Franz Josef van der Staay;;Linda A.W. Jans;;Sven Akkerman;;Harry W.M. Steinbusch;;Arjan Blokland;;José van’t Klooster;;Jos Prickaerts.Behavioural Brain Research,2012(2)

• Object recognition testing: Methodological considerations on exploration and discrimination measures[J]. Sven Akkerman;;Arjan Blokland;;Olga Reneerkens;;Nick P. van Goethem;;Eva Bollen;;Hieronymus J.M. Gijselaers;;Cindy K.J. Lieben;;Harry W.M. Steinbusch;;Jos Prickaerts.Behavioural Brain Research,2012(2)

• 宋广青,孙秀萍,刘新民.大鼠物体识别实验方法综述[J].中国比较医学杂志,2013,23(07):55-60+67.

• The effects of hippocampal lesions upon spatial and non-spatial tests of working memory. JP Aggleton;PR Hunt;JNP Rawlins.Behav Brain Res.1986

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