动物模型与评估丨动物嗅觉障碍模型构建与行为学测试

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选取健康BALB/c小鼠40只，均符合SPF级标准，6～8周，体重20～30 g，饲养于无菌、恒温及暗明交替的清洁级环境中，5只/笼，湿度60%，温度23～25℃，随意进食，取水，自由活动，适应性饲养7 d，避免外界刺激，每周称定一次体重。将小鼠随机分为观察组与对照组，每组各30只，观察组小鼠建立嗅觉障碍模型，对照组不进行处理。

模型建立

建立嗅觉功能障碍模型的给药办法主要有两种：鼻腔局部给药法和全身注射给药法。局部药物包括非离子表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚（TritionX-100）、二氧化硫（sulfur dioxide）、硫酸锌（zinc sulfate）以及甲基溴（methylbromide）等，全身性药物包括3-甲基吲哚（3-methylindole）、甲硫咪唑（methimazole）和双氯苯酞等，TritonX-100较其他药物更具优势，它通过药物滴鼻引起小鼠嗅觉障碍，成功破坏后小鼠死亡个数较少，且不毁坏小鼠的运动能力，正常培养一定的时间，可恢复小鼠的嗅觉能力。因此，作者选择该试剂诱导小鼠产生嗅觉障碍，是一种有效的简单的造模方法且对小鼠的副作用小，但考虑造模的有效期，在实验过程中，隔一定的时间应反复灌注，使实验组试鼠始终处于嗅觉障碍。

嗅觉丧失组（Anosmia组）:采用生理盐水按体积比稀释TritonX-100为0.7%，用移液枪将配置好TritonX-100稀释液缓慢滴入实验组小鼠的双侧鼻腔，轻轻摇晃小鼠头部使液体充分流入鼻腔，每侧鼻腔150μl，连续处理7d，每天1次。还有研究采用采用玉米油溶解3-甲基吲哚至15 mg/ml，腹腔注射，0.15 g/kg。对照组小鼠给予同等剂量的玉米油。

健康对照组（Control组）：健康对照组C57/BL小鼠对照组用体积相同的生理盐水代替灌注。

注意：现配现用；灌注时应缓慢进行，液体控制在60-100s滴完，防止引起吸入性肺炎导致实验动物死亡。

C57/BL小鼠的体重早上九点用电子天平测量，并且小鼠被放在一个已知食物量（50g）的笼子里。第三天，测量剩余食物的量，并根据这些值之间的差值计算食物摄入量，一共检测18天；通过Q-BOX高通量动物呼吸作用测量系统对动物进行代谢率的检测。

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行为学评估

觅食实验（buried food pellet test, BFPT）

造模结束第3天、15天、25天后对小鼠进行食物颗粒找寻实验，对建立的嗅觉丧失模型进行有效性验证。选用40 cm×24 cm×20 cm的带盖长方形盒子作为测试容器，将小鼠放置测试容器内，自由活动30 min，熟悉周围环境，实验前12 h，小鼠禁食但不禁水。测试容器内铺3 cm左右的垫料，将0.5 g左右的食物小球埋藏于距表面0.5 cm的垫料中，记录小鼠找到食物小球的时间（以牙齿或爪子接触到食物为准），平行测定3次，取平均值，若小鼠5 min内未找到食物，则将小鼠移出，并将时间记录为5 min。

嗅觉丧失模型有效性验证

制作一长×宽（1.5m × 0.2m）的长方形沙盒，其底部填一层干净细沙，将鼠粮埋藏在沙盒中央约1.5cm深。实验前将所有试鼠饥饿处理24h，但不限制其饮水，并且每天让他们在制作好的沙盒中自由活动20 - 30min，以熟悉实验环境。第3天晚上8时引入已饥饿处理的试鼠一只。以5min为参考标准，若5min之内动物成功找到食物则记录找寻成功（记为1）且如实记录时间；若5min之内动物未能找到食物则记录找寻失败（记为0）且记录找寻时间为5min。注意：以小鼠前爪成功抱起食物为标准判定食物找寻成功，每次实验完成后及时清理沙盒中的粪便，防止对下一次实验造成一定的影响。本研究旨在通过比较嗅觉功能障碍稳定期患者各指标的差异，研究体重与嗅觉障碍功能的相关性，为临床AD病情评估、疾病的预防及干预提供新思路。

造模25天后分别开始对小鼠进行旷场、巴恩斯迷宫实验。

旷场实验系统（Open field test, OFT）

分别对造模后嗅觉丧失组、健康对照组小鼠于25d天后进行旷场分析。旷场行为学分析装置置于动物行为学实验室。旷场分析箱规格由450cm × 450cm ×400cm（长×宽×高）的无盖透明隔板组成，且底部为黑色，沿边墙9cm宽度处称为边缘区域，其余称为中心区域。动物行为学实验室保持安静，室内通风；实验时实验人员距离旷场分析箱要有一定的距离，以保持动物不被干扰。实验前现将动物单独拿出，适应新环境5min，再将动物放于旷场实验正式开启实验，用Any-maze7.0动物行为分析系统实时监控记录小鼠的，记录动物在旷场中的运动轨迹、运动区域和不同运动区域所花费的时间以及运动距离，最后通过人工目测数小鼠5min内前双脚的站立次数。每只动物的实验测试时间均为5min。每只动物实验前用75%的酒精擦拭旷场分析箱，排出鼠味以及其它因素的干扰。

巴恩斯迷宫实验系统（Barnes maze test）

本次实验使用巴恩斯迷宫，它是由特级有机板制成的一个圆形平台，可旋转，直径90cm。平台周边有20个等距离圆洞；洞的直径为5cm。其中一个洞（称为目标洞）与一暗箱（即目标箱）相联。其他圆洞则为空洞，不与任何物体相联。暗箱设置成抽屉式，便于从中取出动物。从平台表面看不见目标箱。迷宫抬高140cm。动物通过目标洞可逃至目标箱内。通过训练，动物获得对目标洞的空间定位。

（1）实验开始前一天，将动物单个从目标洞置于目标箱内适应5min。

（2）将动物置于迷宫中央的塑料圆桶（直径20cm，高27cm）内限制活动5s。

（3）移开圆桶，启动计时器。动物四肢均进入目标箱，则计为一次逃（escape），并让动物在箱内停留30s。每一动物一次最多观察4min。在此期间如果动物仍然找不到目标箱，则将动物从迷宫移开，放入目标箱内并停留30s。利用这一间隙清洁迷宫。动物每天训练一次，连续5d。

（4）从第二次训练开始，每次训练之前将迷宫随机转动一个至数个洞的位置，但目标箱始终固定在同一方位。这样做的目的是防止动物依靠气味、而非凭借认知来确定目标洞的位置。

实验记录以下参数：探究任何一个洞的潜伏期、到达目标箱的潜伏期和每只动物的错误次数（一次错误定义为动物把头伸向或探究任何一个非目标洞，包括专注于探究同一个非目标洞）。实验过程使用动物行为分析软件进行数据收集。

文献引用：

• Olfactory dysfunction in aging and neurodegenerative diseases.[J]. Dan Xiuli;Wechter Noah;Gray Samuel;Mohanty Joy G;Croteau Deborah L;Bohr Vilhelm A.Ageing research reviews,2021

• 范琼,朱晓宁,葛洪洲,等.TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在嗅觉障碍小鼠模型中的表达变化[J].中国耳鼻咽喉头颈外科,2024,31(02):113-116.

• Olfactory dysfunction in frontotemporal dementia and psychiatric disorders: A systematic review[J]. Sarah Ellen Carnemolla;;Julien Wen Hsieh;;Rebecca Sipione;;Basile N. Landis;;Fiona Kumfor;;Olivier Piguet;;Aurélie L. Manuel.Neuroscience and Biobehavioral Reviews,2020

• 周金慧,邢栋,马哈木,等.嗅觉训练对嗅觉障碍小鼠嗅觉功能影响的实验研究[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2020(02):154-155-156-157-158.

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