香港大学翟元樑团队最新Nature子刊

在真核生物中，起源识别复合体(ORC)促进了复制前复合体(pre-RC)在起源DNA上的组装，以获得复制许可。

2024年9月13日，香港大学翟元樑作为通讯作者在Nature Communications在线发表题为“Replication licensing regulated by a short linear motif within an intrinsically disordered region of origin recognition complex”的研究论文，该研究结果为ORC在G1期支持起源许可及其在S期限制起源激活的调控中的多方面作用提供了重要的见解。

研究酵母Orc2亚基的N端内在无序区(IDR)在这一过程中起着至关重要的作用。从Orc2-IDR中去除一个片段(残基176-200)或突变一个关键的异亮氨酸(194)可显著抑制整个基因组的复制起始。这些Orc2-IDR突变体能够组装ORC-Cdc6-Cdt1-Mcm2-7中间体，该中间体表现出ATP水解受损，无法转化为后续的Mcm2-7-ORC复合物和pre-RC。这些缺陷可以通过Orc2-IDR肽部分修复。此外，S周期蛋白依赖性激酶磷酸化Orc2-IDR区域，阻断其与Mcm2-7复合物的结合，导致pre-RC组装缺陷。

真核生物DNA复制开始于分散在整个基因组中的多个复制起点。为了确保精确的基因组复制，每个起源在每个细胞周期中只被激活一次。这种精确的控制是通过复制前复合体(pre-RC)在起始DNA的G1期组装实现的，然后在细胞进入S期时激活。在酵母菌中，起源识别复合体(ORC)促进了pre-RC组装，ORC结合到包含ARS共识序列(ACS)的自主复制序列(ARS)上。ORC由6个亚基组成，Orc1-6。Orc1-5各具有AAA +或AAA +样结构域和带翼螺旋结构域(WHD)，而Orc6与其他ORC亚基几乎没有相似之处，而是类似于转录因子IIB (TFIIB)。这六个亚基，连同Cdc6和Cdt1一起，共同在起源DNA上将Mcm2-7复合体的两个拷贝组装成首尾相连的双六聚体(DH)。这个过程也被称为复制许可或pre-RC组装。一旦加载，MCM-DH在整个G1期保持非活性。然而，在进入S期后，Dbf4依赖性激酶(DDK)和S细胞周期蛋白依赖性激酶(S-CDK)与多种起源激发因子协同工作，激活MCM-DH，导致两个活跃复制体的形成，驱动双向DNA合成。

酵母复制许可的体外再现为pre-RC组装过程提供了有价值的见解。它从ORC对起源DNA的识别开始，作为后续组装事件的平台。然后，Cdc6被ORC招募，以促进将第一个Cdt1-Mcm2-7七聚体装载到DNA上的瞬时ORC-Cdc6-Cdt1-Mcm2-7 (OCCM)中间体中。在ATP水解后，OCCM经历结构重构，转化为Mcm2-7-ORC (MO)复合物，其中ORC的结合位点从ACS变为下游的B2 DNA元件。MO复合体是指导第二个Cdt1-Mcm2-7七聚体在正确方向上募集的基础，以与最初装载的Mcm2-7融合，形成紧密耦合的DH。最近的单分子研究表明，在MO形成过程中，单个ORC可以翻转负载的Mcm2-7单六聚体以捕获其下游结合位点。为了完成这一过程，ORC必须在从ACS位点释放后，在与B2 DNA重新结合之前，与第一个加载的Mcm2-7保持稳定的联系。Orc6通过其N端结构域(NTD)与Mcm2相互作用，参与了这一过程。然而，OCCM驱动这种转换的确切机制以及ORC如何完成其翻转仍然知之甚少。

Orc2-IDR调节的pre-RC装配模型（图源自Nature Communications）

ORC在起始DNA上的活性受翻译后修饰的调控。由于CDKs在整个细胞周期中的活动，ORC在复制许可中的功能仅限于G1期。已证实S-CDKs靶向Orc2和Orc6，对ORC有抑制作用。最近的研究表明，ORC的S-CDK磷酸化不会阻止MCM向起源DNA募集。然而，它显著抑制MO的形成。有趣的是，Orc6磷酸化允许其NTD与ORC-Cdc6复合物相互作用，特别是在与Mcm7的C端WHD共享的表面，减缓OCCM的形成。然而，S-CDK磷酸化Orc2如何阻断pre-RC组装的分子细节尚不清楚。

研究阐述了Orc2的N端IDR，并确定了一个对细胞活力至关重要的含有α-螺旋(SH)的短片段(176-200)。进一步的分析表明，通过OCCM调节ATP水解来促进pre-RC组装，该IDR区域是MO形成所必需的。此外，S-CDK靶向Orc2-SH抑制磷酸化以阻断复制许可。研究的发现为嵌入在Orc2-IDR中的短线性基序在DNA复制起始调控中的重要作用提供了机制见解。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41467-024-52408-0