动物模型与评估丨睡眠剥夺动物模型构建与评估

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REM睡眠剥夺建模

单平台睡眠剥夺方法：

单平台睡眠剥夺方法最早由Jouvet等开发并用于猫的REM睡眠剥夺，后续经过Cohen等的修改用于剥夺大鼠的REM睡眠。该方法将一个狭窄平台（直径6.5cm）放置在长40.0cm×宽34.0cm×高16.0cm的水槽中，往水槽中加水至平台下1.0cm。将1只大鼠置于狭窄平台上，当进入REM睡眠阶段时，动物会失去肌肉张力并接触水，从而觉醒。对照组通常是笼养对照动物或在完全相同的环境条件下将大鼠放置在宽平台上（直径14.0cm）。这种方法因为使动物受到了额外的不良刺激而广受争议，这些不良刺激可能会引起除实验目的以外的影响。例如，长期使用这种方法会导致动物下丘脑⁃垂体⁃肾上腺（HPA）轴的重度激活，并且会诱发应激反应和体温过度升高。

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多平台睡眠剥夺方法：

为了减少单平台睡眠剥夺引起的应激反应，多平台睡眠剥夺方法将1只动物放入一个包含7个平台的大水箱中，运动范围较单平台睡眠剥夺明显增大，从而消除单平台技术中的运动限制。尽管如此，仍存在许多与应激相关的改变，例如胸腺萎缩、体重减轻、肾上腺肥大和酪氨酸羟化酶活性增强等。

改良多平台睡眠剥夺方法：

为了减轻睡眠剥夺过程引起的社交隔离，多平台睡眠剥夺法被进一步改良发展为改良多平台睡眠剥夺法。该方法将来自同一个饲养笼中的10只大鼠放入装有14个狭窄平台的水箱中进行REM睡眠剥夺。其中，平台直径6.5cm，水箱长127.0cm×宽44.0cm×高45.0cm，水箱需将水加至平台下1.0cm，动物可以在水箱中自由活动并获取饮用水和食物。实验者需维持剥夺房间正常昼夜节律和温度，并且每天更换水箱中的水。改良多平台睡眠剥夺法最常使用大鼠和小鼠，其中SD大鼠、Wistar大鼠、ICR小鼠和c57BL/6J小鼠使用频率更高。小鼠常用的平台直径为3.0~3.5cm；平台与平台之间的间隔距离以动物能在平台间自由活动，但不能倚靠两个平台或水箱边缘入睡为宜，大鼠所在睡眠剥夺箱中的平台间距一般设置为7.0~10cm，小鼠则多设置为5.0cm。值得注意的是，在这个方法中同一个水箱中的实验对象需是来自同一个饲养笼中的动物。因为在第一个改良方案中，Nunes将来自不同笼子的10只大鼠放置在同一个实验箱中。然而，Suchecki等发现放置在这种环境中的动物HPA轴激活甚至大于单平台睡眠剥夺的大鼠，他们推测在这个过程中这些来自于不同群体的大鼠需要重新建立等级制度，这一额外增加的社会不稳定因素可能是导致HPA轴过度激活的原因；在其后续研究中也验证了这一假设。

平台水环境法:

平台水环境法的原理是动物进入REM睡眠后肌肉张力消失，从平台掉落水中惊醒，造成REM睡眠剥夺。造模方法为将动物放在实验箱内直径较小的平台上，平台对于小鼠多设定为直径约2cm、高约5cm;对于大鼠直径约6.5cm，高约8cm。实验箱内注入自来水，水面高度距离平台面约0.5～1cm。此方法包括:(1)单平台法即实验笼内仅设置一个平台，可避免动物相互干扰，但会造成单笼饲养的隔离应激，甚至出现社交障碍;(2)多平台法可同时进行多只动物的REM睡眠剥夺，并且动物可在各平台上自由活动。故多平台法应用较广泛。该方法可针对性剥夺REM睡眠，缺点是若造模时间过长或强度过大，可能出现动物掉落水中因体力不支无法返回平台而死亡的现象。故不适合长期且高强度造模。Machado等应用直径为6.5cm的平台，对大鼠进行单平台法和多平台法的睡眠剥夺，发现在造模期间，两种方法不仅能基本完全剥夺动物的REM睡眠，更显著减少慢波睡眠。

完全睡眠剥夺建模

强制运动：

早期的完全睡眠剥夺通过电动驱动皮带不断旋转跑步机或跑轮，使动物不断运动而持续保持清醒。鉴于上述方法不能灵活地设置剥夺的模式，有团队开发了自动跑步机，可以周期性地使动物不断运动而达到睡眠剥夺的效果；他们将大鼠放置于58.0cm×40.0cm×10.0cm的跑步机上，跑步机的速度设置为10cm/s，工作周期设置为打开3s，关闭12s，以保证动物有足够的休息时间。在此基础上，有研究人员再次升级了这套装置，他们将脑电图和肌电图添加到自动装置中，当肌电图低于阈值时会触发跑轮运动，从而达到更精确的睡眠剥夺的效果。

水平转盘睡眠剥夺法：

水平转盘睡眠剥夺法最早由Rechtschaffen等应用在睡眠剥夺中，实验装置由一个电脑控制台、一个水平转盘及两个开放的长方形有机玻璃缸组成。在实验前1周在大鼠头颈部植入微电极并提前适应1周，正式实验时将微电极与电脑控制台相连，当识别到动物进入睡眠阶段，控制器会激活转盘以3.5rev/min的速度旋转，直到大鼠被唤醒的时间超过6s。转盘的转动的方向是随机的，并且动物能自由地获取饮用水和食物。

轻柔刺激法：

轻柔刺激法在短期睡眠剥夺实验中应用较多，实验者通过温和的刺激干预动物睡眠，可有效减少90%~95%的NREM睡眠并消除REM睡眠。该方法在啮齿动物的饲养笼中进行，实验者通过观察或结合脑电图、肌电图在动物即将入睡时给予外部刺激（如：轻微的噪音、敲击笼子、轻轻摇晃笼子、用刷子尖轻触），使动物无法入睡；或者通过放入新物体和筑巢材料鼓励动物自发探索，从而达到睡眠剥夺的效果。这些轻柔的处理可以明显减少应激反应，也能避免过度运动，但是这种方法非常耗费人力。

触碰法:

触碰法指通过轻柔触碰动物、晃动或拍打鼠笼以干扰动物的睡眠造成动物失眠的方法。触碰的方式可为人工手动触碰，也可利用仪器，选取毛刷、杠杆或木棒进行自动触碰。晃动笼具既可手动摇晃，也可将其放在摇床或可移动的平面上以达到使动物保持清醒的目的。该方法具有刺激强度小、对动物干扰小的优点，且无持续性压力。人工干预的方法较易实施，但对实验者的专注力、体力要求较高，只适合短时间造模。若采用仪器进行自动干扰，短期或长期造模均可。Wallace等利用此方法研究睡眠碎片化对小鼠的影响。动物放入含杠杆的鼠笼中，杠杆每2min自动转动10s，当触碰到动物时，动物被唤醒。脑电监测结果显示，这一过程中动物的非快动眼睡眠(nonrapid eye movements sleep，NRMES)和快动眼睡眠(rapid eye movement sleep，REMS)时间显著减少，觉醒次数明显增加。研究多利用此方法观察不同处理的小鼠在短时睡眠剥夺后，睡眠恢复的差异性。现已成为最常用的睡眠剥夺方法。

剥夺杆睡眠剥夺法：

为了避免过度运动对剥夺结果产生影响，Ramesh等和Christie等开发了剥夺杆睡眠剥夺法，他们将动物放置于带有剥夺杆的装置内，该剥夺杆可以扫过笼子的底部，以迫使动物被轻推而醒来。在一些实验中，该剥夺装置可以按照设定好的时间表移动剥夺杆，而另一些实验则利用实时反馈的脑电图，仅在检测到特定睡眠阶段时移动剥夺杆，这种剥夺方法能成功有效地减少NREM睡眠并消除REM睡眠，同时最大限度地减少了动物的运动和压力。

调控睡眠环路诱导睡眠剥夺

上述几种睡眠剥夺方式均会不同程度引起睡眠剥夺以外的不良反应，而早在1984年时，就有研究人员通过直接电刺激中脑网状结构来反复唤醒大鼠。这种剥夺方法可以减少70%的REM睡眠，而慢波睡眠只减少10%，并且和压力相关的指标也没有明显改变。近些年来，不少研究人员在使用光遗传学或化学遗传学调控睡眠⁃觉醒神经环路诱导睡眠剥夺方面也取得了进展，这种调控睡眠环路诱导睡眠剥夺的方法主要是通过靶向特定受体来增加促觉醒中心的活性或降低促睡眠中心的活性来实现的，例如，刺激臂旁核或下丘脑乳头上核（促觉醒中心）中的神经元可以延长觉醒时间，而沉默腹外侧视前核或基底前脑（促睡眠中心）中的神经元可以减少睡眠。然而，睡眠和觉醒都是由多个协同工作的大脑区域控制，因此，仅选择性地调控一个大脑区域可能无法消除总体的睡眠。不过诸如此类的技术可以提供精确的时间和空间分辨率，根据所选目标研究特定睡眠阶段、神经元群或大脑结构的功能。更重要的是，应用此类方法通常不会引起动物应激反应的激活，因此，这提供了一种在没有压力作为混杂变量的情况下研究睡眠不足影响的方法。

疼痛诱导的睡眠剥夺

在目前已有的啮齿类动物病理性疼痛模型中，不少研究人员观察到疼痛状态下动物睡眠质量降低，睡眠结构发生改变。如将完全弗氏佐剂注射到大鼠后爪中可减少其总睡眠时间、增加NREM睡眠潜伏期、增加NREM发生次数、降低睡眠质量、增加总觉醒时间。在其他类型的关节炎大鼠模型中也存在清醒时间增加，总睡眠时间减少的改变。有实验结果表明，在慢性缩窄性损伤模型中出现持续的睡眠障碍，但这一实验结果在其他实验中并不稳定。此外，在术后疼痛模型中也观察到了慢波睡眠总时间减少和振幅下降。伤害性疼痛、神经病理性疼痛均能不同程度地引起睡眠障碍，不过这些疼痛模型和睡眠之间的相互作用还需要更多的研究。

利用大小鼠睡眠剥夺仪（型号：XR－XS108）对SD组小鼠进行连续３天的睡眠剥夺，睡眠剥夺期间为小鼠提供新鲜的食物、水和洁净的垫料。该睡眠剥夺仪通过底部金属棒的旋转来模拟触觉刺激以对实验动物进行睡眠剥夺。金属棒的旋转速度大约为３转每分（Revolutions Per Minute，ROM），并随机逆转旋转方向，以防止实验动物通过适应旋转模式而获得短暂睡眠。睡眠剥夺仪如图所示。

Fig1大小鼠睡眠剥夺仪

物理刺激

滚筒法:

滚筒法(转轮法)的原理是将动物放入滚筒等装置中，装置自动旋转，动物被迫随装置转动而运动，导致无法入睡或短暂睡眠后觉醒。实验除设有对照组和睡眠剥夺组外，常增加强迫运动组，目的在于排除运动对动物睡眠相关指标的影响。强迫运动组的装置转速多设置为睡眠剥夺组的两倍，时间减少一半，保证充足的睡眠。此方法的特点为造模强度大，可实现完全睡眠剥夺，重复性和可靠性高，但对动物的体力消耗大，对仪器的稳定性要求较高。Dispersyn等将小鼠放入滚筒(外径35．6cm，内径20.9cm)中，滚筒以3m/min转3s，停12s的方式自动旋转，以探究睡眠剥夺24h和恢复期48h内小鼠睡眠的变化。结果表明小鼠24h内觉醒时间达97%，恢复期第1天7:00～19:00，小鼠NREM和REM睡眠明显反弹。

除触碰法、平台水环境法和滚筒法外，水上网格法、水上转盘法等也可应用于失眠动物的造模，但据近十年文献统计发现已较少应用。

慢性不可预知温和应激:

慢性不可预知温和应激模型(chronic unpredictable mild stress，CUMS)，早期又名慢性温和应激模型(CMS)，由Katz等于1981年首先建立。造模期间动物历经潮湿垫料、空瓶、禁食、冰水游泳、热水游泳、夹尾、昼夜颠倒、电击等操作，最终造成快感缺失、焦虑、抑郁和学习记忆障碍等。此模型大多用于焦虑、抑郁、认知等方面的研究，也有研究显示其会对睡眠造成影响。Mou等对SD大鼠进行28d的慢性不可预知温和应激后，向大鼠腹腔注射50mg/kg戊巴比妥钠，观察到模型大鼠的睡眠时间显著缩短。Nollet等对小鼠进行9周的CUMS造模，并间隔进行脑电监测。结果显示，造模仅3d即可使小鼠的REMS时间显著增加，并持续至造模结束;NREMS在整个周期内时长无显著变化，但呈碎片化。

慢性束缚:

束缚是将动物放入狭小的束缚装置中，限制动物的运动空间和范围，造成心理和生理的双重压力，具有简单易操作、无痛且持久的特点。慢性束缚不仅使动物情绪、学习记忆等行为学指标、炎症指标发生变化，也可造成睡眠障碍。陆婷婷将ICR小鼠放入50mL离心管制成的束缚器中，进行3、5或7d的束缚造模，每天9h或12h，并于束缚结束后腹腔注射戊巴比妥钠诱导动物入睡，观察睡眠潜伏期和睡眠时间。束缚后的各组小鼠睡眠潜伏期均延长、睡眠时间均缩短，以每天束缚9h，持续7d最为显著。Yasugaki等对C57BL/6J小鼠进行3周的浸水和束缚实验，将小鼠放入束缚管内，垂直放入水中。每天2h，每周6d，并于各周第7天进行脑电监测。小鼠在给予1、2和3周的压力刺激后24h内均显示出觉醒时间减少，NREMS和REMS时间增加，其中第1周结果最显著，同时伴随REMS次数明显增加。

慢性社会挫败:

慢性社会挫败动物模型模拟人在社会环境中因社会地位等问题产生的心理压力，最终导致社交恐惧和兴趣缺失。动物模型常采用C57BL/6J小鼠，将其放入CD1小鼠的笼中，因CD1小鼠的领地中突然出现其他动物，会攻击C57BL/6J小鼠。造模一般采用每天攻击10min，其余时间用透明隔板隔开的方式。该方法不仅会引起动物的社交障碍，同时会改变其睡眠节律。Henderson等对C57BL/6J小鼠进行10d慢性社会挫败造模，在第1、3、10天进行脑电监测。结果显示1、3、10d社会挫败后3h内觉醒时间显著增加，REMS时间显著减少，NREM睡眠减少;造模后10～22h出现睡眠反弹，觉醒时间极显著减少，NREM睡眠极显著增加，REM睡眠增加。Wells等同样用C57BL/6J小鼠造成社会挫败模型，并每日监测脑电变化。发现造模期间，模型组REMS平均时间显著增加，在第4、5、6、7、9天与对照组有显著性差异，REMS次数对应增加。慢波睡眠时间也呈上升趋势，同时伴随觉醒时间减少。

空瓶刺激:

空瓶刺激模型指动物经过定时喂水训练后，形成条件反射，随后进行不定时空瓶刺激，1d内1～2次，以诱发其情绪应激。于鑫应用慢性情绪应激造大鼠失眠模型。大鼠经历10d定时喂水训练后，进行14d空瓶刺激，应激后大鼠睡眠总时间、慢波睡眠、REM睡眠均缩短。

电击:

电击是可使动物产生恐惧的压力源，大量研究表明其会对动物的睡眠产生影响。王芳等通过电刺激造大鼠失眠模型，参数为电流0.5mA，频率1Hz，刺激30s间隔30min，观察到8h电刺激后SD大鼠睡眠总时间、慢波睡眠、REM睡眠均减少，觉醒时间增加。Yan等也应用相同参数电击造模，观察大鼠经受刺激前后睡眠的变化，结果与上述研究一致。触碰法、平台水环境法和滚筒法模拟因为外界环境干扰所致的睡眠不足，根据造模时间可造成完全睡眠剥夺或部分睡眠剥夺，使动物表现出以睡眠时间减少为特征的失眠症状。慢性不可预知温和应激、慢性束缚、慢性社会挫败、空瓶刺激和电击是通过心理和生理的双重应激，造成动物睡眠障碍，普遍表现为觉醒时间增加，睡眠时间减少。然而，经历慢性社会挫败应激的动物多表现为睡眠时间增加。此外，创伤后应激、冲突性心理应激也可造成动物睡眠障碍，出现失眠症状。

化学因素

对氯苯丙氨酸诱导失眠模型:

对氯苯丙氨酸(4-chloro-DL-phenylalanine，PCPA)是色氨酸羟化酶的选择性和不可逆性抑制剂，色氨酸羟化酶是合成5-HT的起始酶和限速酶。5-HT已被证实在睡眠－觉醒的调节中发挥重要作用，而PCPA可有效阻断95%以上5-HT合成。腹腔注射PCPA造成失眠模型，常用的剂量为300～500mg/(kg·d)，连续注射1～3d。注射PCPA后，动物体内5-HT在至少7d内维持较低水平，9d后可基本恢复正常。该方法造模成功率高，稳定性好，动物出现的失眠症状与人类相似，目前已广泛用于失眠动物实验的研究。

咖啡因诱导失眠模型:

咖啡因是腺苷A1和A2A受体的拮抗剂，其对二者的亲和力相似，无选择性。咖啡因在体内进一步被代谢为黄嘌呤和茶碱，其代谢物可更有效地拮抗A1和A2A受体。腺苷通过与A1和A2A受体结合发挥促进睡眠的作用，故摄入咖啡因后会对睡眠造成影响。该方法非常经典，具有安全性高、成本低、作用明确的优点。但腺苷A2A受体基因的功能多态性会导致咖啡因损害睡眠质量的个体差异，造成实验数据波动较大。咖啡因的造模剂量多选用5～15mg/kg，也可使用25、30或50mg/kg等较高剂量。在睡眠实验检测前30～60min腹腔注射咖啡因，可成功影响动物的睡眠。总结近几年采用咖啡因造模的文献，如表2所示。PCPA和咖啡因造模都会导致动物觉醒时间增加，入睡潜伏期延长和睡眠时间减少，其中REMS、NREMS均减少。除腹腔注射PCPA和咖啡因外，给予动物乙醇，形成乙醇依赖，戒断后可造成动物觉醒时间增加，REM、NREM睡眠时间显著减少。中枢微量注射去甲肾上腺素、食欲素或促肾上腺皮质激素释放激素等，皮下注射阿朴吗啡、氟西汀或育亨宾等同样可导致动物失眠。

病理因素

慢性疼痛常引发失眠，现常采用坐骨神经部分结扎造神经痛模型，研究动物睡眠的变化。模型动物表现出觉醒时间、次数增加，NREM、REM睡眠时间及次数减少。此外，精神类疾病如抑郁症、焦虑症、创伤后应激综合症、癫痫、自闭症等也会引发失眠，高血压、缺血性中风同样会抑制睡眠。

复合因素

根据研究目的不同，常采用多种诱因的复合因素造成失眠模型。应用线栓法(MCAO)和PCPA联合造模研究脑缺血后睡眠障碍，双侧颈总动脉闭塞(BCCAO)和平台水环境法造模研究慢性脑缺血伴发失眠，去势或卵巢切除联合电刺激或触碰等方法研究激素水平降低导致的失眠。负重游泳和PCPA模拟运动性失眠大鼠。

大小鼠失眠模型和评价方法

针对大小鼠失眠模型，构建方法甚多，各具特点，可应用不同角度的评价方法判断造模是否成功，同时可采用这些评价方法进行镇静催眠药物药效学的评价。

常用的评价方法为巴比妥类药物协同睡眠实验，空场实验和脑电、肌电或眼动监测。这些方法既可用于评价失眠模型，也可用于药效学评价。巴比妥类药物协同睡眠实验可初步判断动物的睡眠情况，实验操作简单、成本低，但结果指标较少。空场实验是通过观察动物一定时间内的运动参数，判断其生理状态，多用于镇静催眠药物的评价。脑电和肌电监测可直接将动物的睡眠状态通过波形、波频率等指标呈现，但实验操作复杂，对实验环境要求高。

1.巴比妥类药物协同睡眠实验

巴比妥类药物是常用的催眠药物，可应用其来诱导动物入睡，通过观察动物的行为得到有效结果。实验分为3类:戊巴比妥钠阈下剂量协同睡眠实验观察动物的入睡率、戊巴比妥钠阈上剂量协同睡眠实验观察睡眠时间、巴比妥钠(或戊巴比妥钠)实验观察入睡潜伏期。阈下剂量指80%～90%动物翻正反射不消失的戊巴比妥钠最大剂量，阈上剂量指动物100%入睡的戊巴比妥钠最小剂量。此外，巴比妥类药物硫喷妥钠等也可用于该实验。动物入睡以翻正反射消失为判断标准。给药后待动物基本停止运动时，对其体位进行翻转，即呈仰卧位，若动物30min内仰卧位达60s以上，判断其翻正反射消失进入睡眠状态。一段时间后，当翻正反射首次恢复时，立即将其翻转成仰卧位，30s内若再次恢复，判断为动物觉醒，并记录首次恢复翻正反射的时间为睡眠终止时间;若30s内未恢复，则在动物翻正反射再次恢复后重复翻转，直至判定为睡眠结束。

2.旷场实验

旷场实验是将动物放入实验箱的中心，适应2～5min后，记录并分析动物在一段时间内(一般为5～15min)的运动路程、运动时间、站立次数和运动轨迹等指标，或对动物穿越网格数或直立次数进行水平、垂直评分以反映动物的自主活动情况。失眠动物常表现为自主活动增加，而给予动物镇静催眠药物后，则表现为自主活动减少。

3.脑电图、肌电图、眼点图

脑电图(EEG)和肌电图(EMG)监测是将动物麻醉，插入电极，恢复7～14d后，通过EEG、EMG观察并统计动物觉醒、REM睡眠、NREM睡眠时长，时相出现次数、持续时间、转换次数等指标。失眠动物常表现为睡眠总时间缩短，觉醒增加，各相睡眠时间不同程度缩短;睡眠呈碎片化，即时相出现次数、转换次数增多，持续时间缩短;波形与正常动物存在差异。脑电图(EEG)和肌电图(EMG)可准确反映睡眠过程，为最直接、可靠的评价方法，同时也可应用眼点图(EOG)进行辅助研究。

文献引用：

1.改良的多平台水环境法在睡眠剥夺动物模型中的应用与评价[J]. 刁华琼;张婧;王敏;陈雨菲;朱庆生;李小黎.中国实验动物学报,2023(01)

2.Sleep physiology, pathophysiology, and sleep hygiene.[J]. Baranwal Navya;Yu Phoebe K;Siegel Noah S.Progress in cardiovascular diseases,2023

3.Epidemiology of Insomnia: Prevalence, Course, Risk Factors, and Public Health Burden[J]. Morin Charles M.;Jarrin Denise C..Sleep Medicine Clinics,2022

4.Shining a Light on the Mechanisms of Sleep for Memory Consolidation[J]. Michelle A. Frazer;Yesenia Cabrera;Rockelle S. Guthrie;Gina R. Poe.Current Sleep Medicine Reports,2021

5.GABA and l-theanine mixture decreases sleep latency and improves NREM sleep.[J]. Kim Suhyeon;;Jo Kyungae;;Hong Ki-Bae;;Han Sung Hee;;Suh Hyung Joo.Pharmaceutical biology,2019

6.Loganin Exerts Sedative and Hypnotic Effects via Modulation of the Serotonergic System and GABAergic Neurons[J]. .Frontiers in Pharmacology,2019

7.夏天吉,闫明珠,王智,等.大小鼠失眠模型和评价方法研究进展[J].中国实验动物学报,2022,30(03):428-435.

8.李一男. 睡眠剥夺对小鼠认知功能的影响及运动保护作用研究[D].中国人民解放军海军军医大学,2023.

9.TSPO在小鼠慢性睡眠剥夺后的表达及其配体依替福辛对NLRP3炎性小体影响的初步研究[D]. 郑培.天津医科大学,2019

10.海马IGF-1/PI3K/Akt信号通路在小鼠REM睡眠剥夺后认知功能损伤机制中的作用[D]. 高微.天津医科大学,2019

11.基于小鼠行为及BDNF表达水平检测的睡眠剥夺模型研究[D]. 郁婧.陕西师范大学,2017

找实验方法，上脑声常谈

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