药物基质亚硝胺杂质NDSRI控制策略和分析方法研究

FDA 近日发布了《Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs Guidance for Industry （控制人用药物中的亚硝胺杂质）》指南的更新版本，该指南建议活性药物成分（API）和药品制造商采取的检测步骤以及防止药品中亚硝胺杂质含量超出可接受水平。

指南提及亚硝胺原料药相关杂质 （nitrosamine drug substance-related impurities，NDSRI）。指的是那些药物分子本身参与亚硝胺杂质形成的类型。这些药物中通常都含有二级胺（包括叔胺）结构，为亚硝胺的形成提供了氨基单元。例如重型抑郁症(MDD)治疗药沃替西汀发现的N-亚硝基沃替西汀，结构如下：

1

NDSRI控制策略

相对于NDMA和NDEA这样的单纯亚硝胺杂质，这些产品相关的亚硝胺杂质的上限值被指定得非常低。2023年8月4日FDA公布了NDSRI杂质AI上限设定的指南意见Recommended Acceptable Intake Limits for Nitrosamine Drug-Substance-Related Impurities（NDSRIs）Guidance for Industry [1]，就对AI值未设定的NDSRI杂质的AI设定流程进行了重要的变更。

在该指南文件中，FDA承认并非所有NDSRI杂质都具有相同的致癌性和致畸性（从目前的数据来看，不同亚硝胺分子的致癌性之间存在四个数量级的差异），这主要取决于它们具体的化学结构。AI值的设定，应该考虑这些亚硝胺分子化学结构。

在新的指南文件中，FDA凭借NDSRI分子结构中的活化结构特征（Activating structural features）以及去活化结构特征（deactivating structural features），来预测这些分子的致癌性，并在这个基础上给它们设定相应的AI值。

亚硝胺体内转化为叠氮盐和碳正离子的生物化学过程

在预测NDSRI的致癌性过程中，FDA采纳图中描述的致癌性机理，认为亚硝胺物质的致癌性，源于其代谢过程中的α-碳原子的羟基化，以及在这个基础上所形成的碳正离子物质。

NDSRI上α-和β-碳的结构表示

指南中认定的具有潜在致癌性的亚硝胺化合物，是那些在亚硝胺基团的两侧都结合有一个碳原子的结构（即α-碳原子），而这些碳原子并不直接通过双键与杂原子相连接（例如N-亚硝基酰胺、N-亚硝基胍和其它类似的分子，都排除在此指南之外）。

在这份指南中，FDA对于NDSRI杂质的AI值建立了5个活性级别（Potency Category），对应不同的AI值（注: 级别数越高，其致癌性越低，AI值也就越高；第一级为26.5 ng/天，第二级为100 ng/天，第三级为400 ng/天，第4级和第5级AI值相同，均为1500 ng/天）。

EMA也在Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products[2]中附件2描述了NDSRI杂质致癌性分类方法。两者均采用了CPCA法，通过构-效关系（SAR）评估AI值，且两者适用的结构母体一致，活性指数计算方式相同，和FDA指南的区别主要在于活性级别1的亚硝胺，EMA建议的AI值为18 ng/天，其次EMA也明确了多个NDSRIs评估的标准，并一直在更新。

EMA关于NDSRIs五种预测效力类别和相关AI限制

CPCA分类与活性指数对应关系为：1类—活性指数≤1；2类—活性指数=2；3类—活性指数=3；4类--活性指数≥4）标准如下：

2

相关案例

以N-亚硝基曲美他嗪为例，结构如下图。其两个α碳上有2个H，不包含α叔丁基，故展开计算活性指数。

活性指数

活性指数= α-氢指数+去活化特征指数

（NDSRI中符合该特征的所有指数的加合）+活化特征指数（NDSRI中符合该特征的所有指数的加合）

α-氢指数表

* α-氢指数等于3的示例仅仅局限于所涉及的亚甲基α-碳不隶属于乙基；如果其隶属于乙基，那么α-氢指数应被设定为2，而不是3。

去活化基团与去活化特征指数的关联（计算去活化特征指数时，每个去活化特征对应的指数进行加合，但每项去活化特征只可计算一次）。

*不包括羧基与芳基（单独计算），以及酮基***β-碳必须为sp3杂化。

活化特征指数

活化特征可以增加NDSRI的致癌性，其数值为负值，因为活性指数越低，致癌性越高。（计算活化特征指数时，每个活化特征对应的指数进行加合，但每项活化特征只可计算一次）

活化特征指数

N-亚硝基曲美他嗪结果：

α-氢数量

2,2

α-氢指数

1

去活化特征

整入五元环或者六元环的亚硝胺

去活化特征指数

+2

活化特征

活化特征指数

N-亚硝基曲美他嗪活性指数=3
活性级别3，AI=400 ng/天

3

NDSRI杂质评估

FDA的这份指南以及EMA的答复，为制药及CDMO企业极其关注的NDSRIs杂质阈值含量的设定做出了关键性的指导。

而目前遇到的另一难题是评估可能存在的NDSRIs，在分析方法研究中缺少或难以合成关键性的对照品用以定量分析，取得对应的NDSRI对照品，尤其是活性级别1的亚硝胺，其AI值参考EMA/409815/2020 Rev.17为18 ng/天，对于一些大剂量药物，计算限度则很低，同时又存在基质与目标亚硝胺杂质难分离、干扰大的问题。

微源实验室能对多个品种的NDSRIs杂质进行定量方法开发（以LCMS方法为主），筛选了以下色谱柱，对大部分的NDSRIs与API具有良好的分离。

品牌

填料

键合相

Shimadzu

Shim-pack Velox

PFPP

Shimadzu/Shim Nex

Shim-pack Velox

Biphenyl

Agilent

Poroshell 120

PFP

Waters

Xselect HSS

PFP

Phenomenex

Kinetex Core-Shell

Biphenyl

Velox、Poroshell均是核壳填料，PFP/PFPP（五氟苯基）、Biphenyl（联苯基）键合相对异构体具有较好的选择性，同时部分柱能耐100%水相。

同时，针对NDSRIs难以合成，或合成后稳定性较差，提供了以下建议[3]：

通常可将亚硝酸钠和盐酸反应,制备不稳定的亚硝酸，溶液体系中会存在NO+, 接着NO+受到胺中N原子上的孤对电子的亲核进攻，生成亚硝铵盐。机理如下：

三级胺：三级脂肪胺N原子上没有H原子，其生成的N-亚硝铵盐在低温一般可稳定存在，高温易分解；

二级胺：二级脂肪胺中N原子有一个H原子，其生成的N-亚硝铵盐失去一个质子后转化为稳定的黄色油状或固体的N-亚硝胺；包括：脂肪仲胺、酰胺、氨基甲酸、羟胺、肼、腙、脲和胍类化合物（脂肪仲胺、羟胺和肼具有一定亲核性，其他较差，反应活性弱，但应考虑强反应或催化条件）；

一级胺：一级胺反应产物不稳定，进而会互变异构转化为羟基偶氮化物，在酸性条件下失水生成重氮盐。

烷基重氮盐非常不稳定，会分解生成N2和C正离子，后续C正离子发生取代、重排、消除等，转化为醇、烯等复杂产物。

此类API亚硝基化条件：

相关试剂：酸（HCl、甲酸等，酰胺类可能需要酸酐）、亚硝酸钠/亚硝酸、亚硝酸酯等。一些磺酰胺使用亚硝酰氯亚硝化，一般需添加催化剂如氢氧化锂，低温反应。

硝基通过还原剂（如氢气\锌粉），在催化剂（Pd/钯碳等），初步还原硝基成亚硝基(控制还原进度,进一步会还原成肼之类)。譬如硝基胍的还原。

N杂环类化合物的加成，譬如A：四氢吡咯、哌啶、哌嗪、吡咯、咪唑、吲哚、嘌呤--（NH）B：吡啶、吡嗪、喹啉、嘧啶等--（N）

一般A类亲核性更大，若含亲核试剂-亚硝基，反应较为容易。例如：

4

NDSRI等基因毒性杂质检测

√ 实验室积累丰富基因毒性杂质研究经验，能对多个品种的NDSRIs杂质提供工艺评估、控制策略制定、分析方法开发、验证及放行检测等一站式解决方案。

√ 针对工艺进行全面评估，结合毒理学数据分析和法规解读，制定合理的控制策略，出具完整的评估及控制分析报告。

参考文献
References

[1]:Questions and answers for marketing authorization holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products, EMA/409815/2020 Rev.17 Corr., 28 July 2023.

[2]:Recommended acceptable intake limits for nitrosamine drug substance-related impurities (NDSRIs), FDA, August 2023.

[3]: Pathways for N-Nitroso compound formation: secondary amines and beyond