北京航空航天大学樊瑜波、李晓明AFM：构建负载姜黄素的PLLA/PCL微纳共轭纤维膜从多个角度协同防止术后粘连

近期，北京航空航天大学樊瑜波教授和李晓明教授在Advanced Functional Materials上发表研究文章：构建负载姜黄素的PLLA/PCL微纳共轭纤维膜从多个角度协同防止术后粘连。基于同一接收转速下微米纤维和纳米纤维取向度不一致的原理，利用共轭混纺技术构建了负载姜黄素（cur）的聚乳酸-聚己内酯微纳共轭纤维膜（poly-L-lactic acid-poly (caprolactone) micro-nano conjugated fibrous membrane， PAPC MCFM）。其中，低取向的聚己内酯（PCL）纳米纤维（118±12 nm）贯穿于高度取向的聚乳酸（PLLA）微米纤维（2.0±0.3 μm）之间，对微米纤维在垂直取向的方向上起到了约束和固定的作用。相比PAPC取向纤维膜（anisotropic fibrous membrane，AIFM），PAPC MCFM 不仅显著提高了机械性能，其垂直微米纤维取向方向上的弹性模量和拉伸强度分别提高了4.5倍和13.0倍。还进一步增强了AIFM的“接触引导效应”，即通过抑制整合素β1激活，纽蛋白表达和黏着斑（FA）形成，以及YAP的核定位激活来抑制成纤维细胞的粘附、增殖和分化成肌成纤维细胞。此外，负载2.5 mg mL −1 姜黄素的 PAPC MCFM还能通过提供抗炎、抗氧化和抗菌功能，并通过减少转化生长因子-β 1（TGF-β1）表达抑制纤维化来进一步预防 POA，在大鼠腹腔和兔硬脑膜下腔中能有效预防术后粘连的发生。

摘要图.与取向纤维膜相比，负载姜黄素的微纳共轭纤维膜具有显著改善的力学性能，可以从多种机制协同阻止POA，包括作为物理屏障，抑制蛋白质吸附，实现抗炎、抗氧化、抗纤维化和抗菌功能，特别是增强AIFM的“接触引导作用”以抑制成纤维细胞粘附、增殖和分化。

研究内容简介

术后粘连（Postoperative adhesion，POA）已成为一个常见但具有挑战性的临床问题。目前，大多数有关防粘连功能的研究主要是通过充当物理屏障或抑制蛋白质吸收来实现。然而，由于各种软组织的生理环境各不相同，影响粘连形成的因素也复杂多样，从单一角度防止不同软组织的 POA 仍然很困难。因此，开发一种能够从多个角度防止粘连的多功能防粘连膜，对不同软组织的防粘连和修复材料具有重要意义。

由于成纤维细胞在 POA 形成过程中起着至关重要的作用，研究人员试图通过抑制成纤维细胞分化为肌成纤维细胞来预防POA。由定向纤维组成的取向纤维膜（anisotropic fibrous membrane，AIFM）已被证明可以通过“接触引导效应”有效阻碍成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。然而，取向纤维膜在对细胞行为的影响上表现出各向异性的同时，在力学性能上也呈现各向异性。其在与纤维取向方向垂直的方向上由于纤维之间缺乏相互纠缠的作用力，而表现出最为薄弱的力学性能，极易造成纤维膜结构的破坏，使得细胞屏障作用失效，防粘连失败。因此，必须在不影响取向纤维对于细胞行为的影响的同时，又加强取向垂直方向上的力学性能。

取向纤维通过其特殊的表面拓扑形貌对细胞行为施加影响的过程称为“接触引导”效应。大量研究表明，这一效应和纤维的直径息息相关，表现出明显的“尺寸依赖效应”。对于成纤维细胞而言，通常认为亚微米而不是纳米级别的静电纺丝纤维膜才能为其排列和伸长提供有效的引导线索。因此，如果用与纤维轴向偏转的纳米纤维来缠绕微米尺度的取向纤维，有望在保持微米纤维对于细胞行为影响的同时，加强取向垂直方向上的力学性能。而在取向静电纺丝的制备过程中可以发现，纤维取向度随着收集转筒转速的增大而逐渐增高。在同样转筒转速下，纤维直径越大，取向度越高。因此，通过调整纺丝溶液的组成成份和电纺参数，有望在相同的转速和电场下纺出取向程度不一致的微米、纳米混合纤维膜，同时实现结构稳定的细胞屏障和对成纤维细胞的“接触引导效应”。

研究发现，粘连的发生和发展涉及到纤维蛋白的过度沉积、成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质的过度沉积、细胞外基质的异常重塑，以及影响整个过程的慢性炎症反应、缺氧引发的氧化应激、细菌感染等等。因此，引入具有抗炎、抗氧化、抗纤维化活性的姜黄素可以实现多功能，进一步防止粘连的发生。

本研究利用共轭混纺技术，通过调节各项制备参数，成功开发了聚乳酸-聚己内酯微纳共轭纤维膜（poly-L-lactic acid-poly (caprolactone) micro-nano conjugated fibrous membrane， PAPC MCFM）。其中，取向度较低的PCL纳米纤维（118±12 nm）与取向度较高的PLLA微米纤维（2.0±0.3 μm）相交，对微米纤维起到约束和固定的作用。与此同时，制备了相同成份的取向纤维膜AIFM和无规纤维膜（isotropic fibrous membrane，IFM）作为对照。实验证明，MCFM具有最低的表面粗糙度，优于AIFM的疏水性和抑制蛋白质吸附的能力。（图1）此外，它还大大提高了AIFM的机械性能（图2）——在垂直于微米纤维取向的方向上，弹性模量、拉伸强度和断裂伸长率分别提高了4.5倍、13.0倍和2.5倍，明显改善了AIFM的结构稳定性。好的疏水性和结构稳定性使其不仅能作为坚固的物理屏障，从而抑制 POA 的形成，还能满足硬脑膜和膀胱等特殊组织修复的防渗漏要求。

图1.PAPC MCFM的制备与表征。(A) PAPC MCFM结构示意图及SEM图像；(B)表面形貌及特性。PAPC IFM、AIFM和MCFM的a) 扫描电镜图像和接触角，b) 实时共聚焦显微镜图像，c) 粗糙度分布；(C) 接触角和粗糙度的定量分析；(D) 蛋白质吸附能力检测，包括吸附BSA的定量分析和吸附FITC标记BSA的激光共聚焦图像。

图2.PAPC IFM、AIFM和MCFM的力学性能分析。(A) a) 微米纤维取向平行方向上的拉伸曲线；b) AIFM 和 MCFM 在微米纤维取向垂直方向上的拉伸曲线和拉伸后的物理照片；IFM、AIFM 和 MCFM 在微米纤维取向（B）平行方向和（C）垂直方向上拉伸强度、断裂伸长率和弹性模量。

通过成纤维细胞的在不同纤维膜表面的黏附、增殖和分化研究发现，由微米纤维组成的AIFM对成纤维细胞具有明显的“接触引导效应”，即引导成纤维细胞沿纤维取向方向对齐和伸长，使其保持纺锤体形态，通过抑制整合素β1的活化、纽蛋白的表达和粘着斑的形成以及YAP的核定位的活化，阻碍成纤维细胞向肌成纤维细胞的粘附、增殖和分化。对于MCFM，贯穿微米纤维的纳米纤维不仅没有影响“接触引导效应”，反而进一步增强了这种效应，其对成纤维细胞粘附、迁移、增殖和分化的抑制作用显著提高。（ 图3和4 ）这些改善主要由于MCFM与AIFM相比密度更高、粗糙度更低、疏水性更强，从而降低了MCFM的蛋白质吸附能力，增强了对细胞粘附的阻力。一方面，纤维膜表面蛋白质吸附能力的降低会限制吸附蛋白质与调节细胞行为的特定受体的结合，从而影响细胞的粘附、迁移和增殖。另一方面，突出的防止蛋白质吸附的能力可抑制纤维蛋白的过度沉积，从而有助于预防POA。此外，低的表面粗糙度为细胞提供更少的黏附位点，不利于其黏附、迁移、增殖与分化。

图3.成纤维细胞在PAPC IFM、AIFM和MCFM表面的粘附、迁移和增殖。(A) a) 扫描电镜图像，b) 细胞铺展面积的定量分析，c) 整合素β1 和纽蛋白表达； (B) 细胞迁移分析，a) 细胞骨架染色荧光显微镜图像，b) 细胞迁移 48h 后在平行和垂直于微米纤维方向的细胞迁移面积定量分析；(C) a) 培养 1、3、5 和 7 天后的细胞 CCK-8 分析，b) 荧光显微镜图像。

图4.成纤维细胞在PAPC IFM、AIFM和MCFM表面向肌成纤维细胞的分化。(A) 不同PAPC 纤维膜表面细胞的α-SMA 表达；(B) COL-Ⅰ分泌；和 (C) YAP 核定位的激活。a) 表示 YAP 的免疫荧光染色；b) YAP 核定位激活比例的统计分析。

炎症已被确定为导致 POA 形成的重要因素，一些研究已经通过开发抗炎生物材料来预防POA，并获得了较好的效果。在这项研究中，姜黄素因其强大的抗炎和抗氧化特性而被负载到MCFM中。为获得合适的姜黄素负载量，分别制备了负载0 mg/mL，0.5 mg/mL，2.5 mg/mL，5 mg/mL姜黄素的PAPC MCFM，并通过一系列的体内外实验，筛选出了具有相对最优的抗炎、抗氧化、抗菌、抗纤维化效果的2.5 mg/mL姜黄素负载量，用于后续的体内防粘连研究。（ 图5 ）

图5.PAPC MCFMs（cur）的体内抗纤维化能力。(A）植入14天后，材料周围组织中波形蛋白的a）免疫组化分析和 b）定量分析；（B）α-SMA 和胶原 I 的a）免疫荧光分析，b）胶原 I 和 c）α-SMA 的定量分析；（C）TGF-β1 的a）免疫组化分析和b）表达的平均面积。

进一步，将IFM，AIFM，MCFM，MCFM(cur) 分别植入大鼠腹腔和兔子硬脑膜下开展术后防粘连研究。结果发现，在兔硬脑膜下和大鼠腹腔的防粘连情况相似，IFM，AIFM，MCFM，MCFM(cur) 的防粘连效果逐渐增强。在硬脑膜下（ 图6 ），IFM组，膜与下方脑组织发生明显粘连，其表面覆盖着一层厚厚的组织，即使用镊子也很难将其与脑组织分离；AIFM组的粘连程度较轻，表面黏附有一层薄组织，在镊子剥离过程中，由于微纤维垂直方向的机械弱点，结构发生了塌陷；MCFM与脑组织的粘连极小，它可以从脑组织表面完整剥离，但其表面有一些小血管。MCFM（cur）可以从下层脑组织完全剥离，表面光滑，且没有血管或组织。在腹腔植入中（ 图7 ），IFM表面有多个面积较大的足底粘连以及焦点粘连，并伴有富含血管的薄组织层；AIFM 表面足底粘连或焦点粘连明显减少，表面的薄组织层血管较少；MCFM 组和 MCFM（cur）组中几乎没有粘连，不过，在MCFM组中，腹壁切口边缘附近发现了一些组织，且表面有少量血管，而MCFM（cur）组显示出明显光滑的表面，没有组织覆盖，显示了突出的防粘连效果。这表明 MCFM（cur）具有出色的抑制细胞在材料表面增殖和迁移的能力，因此特别适用于腹腔等大面积组织缺损的防粘连应用，相比那些只证明了一定时间内未形成粘连而没有解决潜在的表面长期反应的材料更有优势。

图6.不同PAPC纤维膜植入兔硬脑膜下14天后的粘连情况。(A) a) 材料与脑组织粘连情况及切除的材料与粘连组织的直观图；b) HE 和 Masson 染色结果，红色和蓝色虚线分别表示材料与粘附组织的分界线和材料与硬脑膜组织的分界线。★表示材料， ★ 表示附着的脑组织，红色箭头表示血管。(B) 不同组在兔硬脑膜下植入14天后的粘附评分。

图7.不同PAPC纤维膜植入大鼠腹腔14天后的粘连情况。(A) a) 材料与腹腔内盲肠组织粘连情况以及切除的材料与粘连组织的直观图，黄色圆圈代表粘附部位；b) HE 和 Masson 染色结果，黑色虚线为聚丙烯非生物降解网与纤维膜的分界线，蓝色虚线为纤维膜与粘附组织的分界线，红色虚线为粘附组织与盲肠的分界线，红色箭头代表血管，★表示材料区域， ★ 表示粘附组织， ★ 表示盲肠；(B)植入大鼠腹腔14 天后不同组的粘附评分。

因此，PAPC MCFM（cur）可以作为坚固的物理屏障，抑制蛋白质吸附，并通过增强取向纤维提供的“接触引导效应”，有效抑制成纤维细胞的粘附、增殖和分化。此外，还能通过减轻炎症和氧化应激，并通过抑制TGF-β1的表达进一步抑制纤维化。通过这些作用，从不同角度阻止了粘连的形成和发展。（ 图 8 ）也就是说，MCFM（cur）通过多种机制协同阻止 POA 的形成。

图8.PAPC MCFM（cur）预防POA的机制。MCFM和MCFM（cur）可增强AIFM的“接触引导效应”，通过抑制整合素β1的激活、纽蛋白的表达和粘着斑的形成、以及YAP的核定位激活，抑制成纤维细胞的粘附、增殖以及向肌成纤维细胞的分化。除了这些作用，MCFM（cur）还能从其他方面协同预防 POA，包括作为物理屏障、抑制蛋白质吸附以及实现抗炎、抗氧化、抗纤维化和抗菌功能。

总之，本研究成功制备了PAPC MCFM（cur），其在防止大鼠腹腔和兔硬脑膜的术后粘连方面表现出显著效果。一系列体外和体内实验表明，PAPC MCFM（cur）能从多个角度协同防止 POA 的形成，这对开发各种软组织的抗粘连和修复材料具有重要意义。此外，其独特的微纳共轭结构还能为利用定向纤维来影响细胞行为的研究提供参考。同时，因其理想的疏水性和结构稳定性，PAPC MCFM（cur）也适合应用于硬脑膜和膀胱等特殊部位。未来，将进一步构建基于 PAPC MCFM（cur）的防粘连、促再生的Janus 膜，以满足特定组织的再生和机械要求。

论文第一/通讯作者简介

廖婕（第一作者）： 北京航空航天大学生物与医学工程学院博士研究生。主要从事硬脑膜修复体及多功能防粘连膜的研发工作。

樊瑜波（通讯作者）：北京航空航天大学生物与医学工程学院教授 、博士生导师 ，北京航空航天大学医工交叉创新研究院院长、医学科学与工程学院院长、生物与医学工程学院院长，国家医学攻关产教融合平台（医工结合）主任，北京生物医学工程高精尖创新中心主任，生物力学与力学生物学教育部重点实验室主任。长江学者，杰青，国家自然科学基金创新群体带头人，科技部重点领域创新团队带头人，国务院政府特殊津贴获得者。美国医学生物工程院（AIMBE）、国际医学和生物工程科学院（IAMBE）、国际医学物理与生物医学工程联合会（IUPESM）、国际生物材料科学与工程学会(FBSE) 会士。国务院学位委生物医学工程学科评议组成员。北航生物与医学工程学院创始院长；曾担任中国生物医学工程学会理事长（2008-2015）、世界华人生物工程联合会（WACBE）主席、民政部国家康复辅具研究中心主任、附属康复医院院长（2015.1-2020.7） 等。从事生物医学工程、医疗器械、康复辅具等领域研究。发表SCI论文400余篇(通讯或第一作者）、H因子83、Elsevier生物医学工程高被引学者。授权发明专利200余项，获部省级科技及教学奖励13项。

李晓明（通讯作者）：北京航空航天大学生物与医学工程学院教授、博士生导师、北京市科技新星、教育部新世纪优秀人才、霍英东青年教师基金获得者，入选美国斯坦福大学与爱思唯尔数据库发布的“World’s Top 2% Scientists 2023”的“career-long impact”及“single-year impact”名单。主要从事组织修复材料和组织再生工程等相关的教学科研工作，以第一或通讯作者发表SCI论文100余篇，被SCI他引5000余次，其中5篇超过200次，12篇超过100次，9篇被收录为ESI高被引论文；出版中文专著2部、英文专著2部；现任中国生物材料学会智能仿生生物材料分会副主任委员，Tissue Engineering、中国修复重建外科杂志等国内外杂志的编委，International Journal of Polymer Science、Biomimetics等SCI杂志的Lead Guest Editor；Science等杂志的稿件评审人。

该研究获国家自然科学基金（Nos. 32171345, 12332019, U20A20390），北京市科技新星计划交叉合作课题（20230484464），霍英东教育基金（No. 141039），中国科学技术部航天生物技术与医学工程国际联合研究中心，以及“111”项目（B13003）等的支持。

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来源：高分子科学前沿

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