中药单体-温医大揭示葛根素拮抗TLR4/myd88抑制巨噬细胞M1型极化,减轻肾脏炎症损伤

葛根素是一种异黄酮衍生物，是从传统中药葛根中提取的主要生物活性成分。在临床上已被广泛用于改善微循环和治疗心血管疾病。大量研究证实葛根素具有抗纤维化、抗氧化、抗炎、免疫调节等特性。此外，葛根素已被证明通过促进巨噬细胞M2极化来抑制炎症因子的释放并改善糖尿病小鼠的伤口愈合。考虑到这些发现，假设葛根素可能通过调节巨噬细胞M1/M2极化平衡来调节AKI期间的炎症反应并减缓其进展。

2024年6月8日，温州医科大学研究人员在Phytomedicine在线发表了题为“Puerarin suppresses macrophage M1 polarization to alleviate renal inflammatory injury through antagonizing TLR4/MyD88-mediated NF-κB p65 and JNK/FoxO1 activation”的文章。揭示葛根素通过拮抗TLR4/ myd88介导的NF-κB p65和JNK/FoxO1活化，抑制巨噬细胞M1型极化，减轻肾脏炎症损伤。

摘要

葛根素可有效减轻lps诱导和uuo诱导的AKI大鼠的肾功能损害和炎症反应。在体外，葛根素处理可抑制LPS刺激的Raw264.7细胞M1型巨噬细胞极化和炎症因子释放。机制上，葛根素下调NF-κB p65和JNK/FoxO1信号通路的活性。应用SRT1460激活FoxO1或茴香霉素激活JNK消除了葛根素介导的JNK/FoxO1信号抑制，导致巨噬细胞M1型极化受到抑制，炎症因子减少。进一步研究表明，葛根素结合MyD88蛋白的Toll/白细胞介素-1受体(TIR)结构域，阻碍其与TLR4的结合，最终导致下游NF-κB p65和JNK/FoxO1信号失活。葛根素通过TLR4/MyD88通路拮抗NF-κB p65和JNK/FoxO1活化，从而抑制巨噬细胞向M1表型极化，减轻肾脏炎症损伤。

1.葛根素可减轻lps诱导的肾损伤和炎症反应

首先，通过腹腔注射LPS建立了脓毒症相关性AKI模型(图1b)， LPS组在开始处理后16 h SCr和BUN水平升高，表明模型建立成功。重要的是，这两种标志物的水平在葛根素处理后显著降低(图1c)。肾组织的HE染色也显示，在葛根素处理后，局部肾小管刷状缘缺失，肾小管扩张和上皮细胞萎缩显著减少(图1d)。此外，葛根素抑制了lps诱导的NGAL和Kim-1 mRNA和蛋白表达水平的增强，这是lps诱导的AKI模型中早期肾损伤的两种生物标志物(图1e - g)。综上所述，这些发现为葛根素对脓毒症相关AKI的保护作用提供了证据。

接下来，研究了葛根素对急性肾损伤炎症反应的影响。lps诱导的促炎因子和趋化因子(包括IL-1β， IL-6和TNF-α)表达水平的增加被葛根素抑制(图2 A-C)。此外，在lps诱导的AKI模型中，葛根素处理显著抑制了巨噬细胞M1型极化，这可以通过减少CD86和iNOS的表达得到证明(图2b和D)。白藜芦醇是一种天然的多酚化合物，以其多种药理活性而闻名。值得注意的是，研究表明白藜芦醇可改善多种肾脏疾病，包括高血压诱发的肾衰竭和糖尿病肾病。因此，本研究以白藜芦醇作为阳性对照。如图1，图2，图3所示，结果表明葛根素和白藜芦醇具有相似的抗炎作用和改善肾损伤的作用。综上所述，这些结果共同支持葛根素通过抑制巨噬细胞M1型极化和减轻炎症反应对AKI发挥保护作用的结论。

图1 葛根素可减轻lps诱导的肾损伤

图2 葛根素可减轻lps诱导的肾脏炎症

2.葛根素可减轻uuo引起的肾损伤和炎症

为了研究葛根素对uuo诱导的AKI小鼠模型的影响(图3a)，首先评估了肾功能和组织病理学变化。在UUO诱导的AKI模型中，SCr和BUN水平升高，而葛根素治疗抑制了UUO诱导的标志物升高(图3b)。肾组织的HE染色也显示，在葛根素治疗后，肾小管损伤的迹象减少(与UUO模型小鼠相比)(图3b)。此外，观察到的uuo诱导的NGAL和Kim-1 mRNA和蛋白表达水平的上调被葛根素有效地抑制(图3d, E)。综上所述，结果证明葛根素对小鼠uuo诱导的AKI具有保护作用。接下来，分析了葛根素对uuo诱导的炎症损伤的影响。观察到的uuo诱导的炎症因子(包括IL-1β， IL-6和TNF-α)释放的增强被葛根素抑制(图3f -i)。此外，葛根素处理也抑制了UUO诱导的巨噬细胞M1型极化(图3g和I)。综上所述，葛根素抑制了UUO模型小鼠巨噬细胞M1型极化和炎症因子的释放，从而减轻了肾损伤。

图3 葛根素可减轻uuo引起的肾功能损伤和炎症反应

3. 葛根素抑制lps诱导的M1型巨噬细胞极化

为进一步研究葛根素对巨噬细胞极化和炎症因子释放的影响，将Raw264.7细胞暴露于LPS (100 ng/ml) 24 h诱导M1型极化。CCK-8实验结果表明葛根素(在0 ~ 200 μM范围内)对Raw264.7细胞的活力没有显著影响(图4a)。后续的体外实验均选择50 μM的葛根素浓度，这是制造商提供的推荐浓度。如图4 B所示，LPS刺激后Raw264.7细胞中促炎细胞因子mrna表达水平上调。然而，葛根素处理显著降低了lps诱导的这些促炎细胞因子表达水平的增强。ELISA法检测细胞培养上清中MCP-1蛋白水平。值得注意的是，葛根素处理组抑制了lps诱导的MCP-1释放(图4 C)。此外，葛根素显著抑制了M1型巨噬细胞功能指标iNOS以及促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的表达(图4 D和E)。最后，流式细胞术检测到CD16/32+巨噬细胞(M1型巨噬细胞)的比例整体下降(图4 F)，进一步证实了葛根素调节巨噬细胞M1型极化的能力。

图4 葛根素抑制LPS诱导的巨噬细胞M1型极化

4.葛根素拮抗lps诱导的巨噬细胞中NF-κB p65和JNK/FoxO1的活化

接下来，检测了NF-κB p65和JNK/FoxO1信号通路的活性，这两条通路是TLR4/MyD88的重要下游炎症通路。值得注意的是，葛根素处理减少了巨噬细胞中NF-κB p65的磷酸化并抑制其核定位，而NF-κB p50的表达和磷酸化没有明显变化(图5 A和B)。此外，免疫荧光染色显示LPS刺激诱导p-p65的核转位，也证实葛根素显著阻碍了这一转位过程(图5 C)。还研究了巨噬细胞中p-JNK的表达及其在细胞核中的定位(图5 D和E)。虽然p-JNK的表达是由LPS刺激诱导的，但这种LPS诱导的p-JNK表达的增强被葛根素处理下调。此外，免疫荧光染色显示，葛根素处理后，lps刺激的巨噬细胞中p-JNK的核定位减少(图5f)。

FoxO1是巨噬细胞极化的关键转录因子，调节FoxO1活性可能影响巨噬细胞表型转换。在体内，FoxO1受JNK或Sirt1的调控，最终调节其生物活性。为了进一步研究FoxO1在其中的作用，检测了葛根素处理对Raw264.7细胞中FoxO1表达的影响。如图5g所示，与单纯LPS刺激相比，葛根素处理显著促进了Raw264.7细胞中FoxO1的磷酸化和乙酰化。此外，免疫荧光染色显示葛根素抑制FoxO1核转位(图5h)。为了进一步了解这一过程，对细胞质和细胞核内FoxO1和磷酸化FoxO1 (Ser 256) [p-FoxO1 (Ser 256)]的分布进行了额外的评估。有趣的是，与LPS刺激相比，葛根素处理显著抑制了FoxO1的核定位，同时增加了其在细胞质中的积累。此外，在葛根素处理后，p-FoxO1 (Ser 256)在细胞核和细胞质中显著上调(图5 I和J)。为了了解葛根素如何增加FoxO1乙酰化，分析了上游蛋白Sirt1的水平，并观察到葛根素处理对Sirt1的表达没有显著影响(图5 K)。因此，葛根素介导的FoxO1调节可能依赖于JNK，而不是Sirt1。

图5 葛根素可抑制NF-κB和FoxO1信号通路的转录活性

5. 激活FoxO1或JNK可消除葛根素介导的M1极化抑制和促炎因子释放

为了探讨葛根素影响巨噬细胞极化和调节炎症反应的可能机制，进行了干预研究。用葛根素处理M1型巨噬细胞后，加入强效Sirt1激活剂SRT1460进一步干预。在RAW264.7中，SRT1460上调Sirt1蛋白水平，促进FoxO1去乙酰化，导致FoxO1水平升高(图6 A)。免疫荧光研究发现，SRT1460抑制了巨噬细胞中FoxO1的乙酰化，增强了FoxO1的核定位(图6 B)。此外，SRT1460处理上调了M1型巨噬细胞标志物的表达，增加了促炎细胞因子的释放(图6 C-G)。此外，sirt1刺激后，巨噬细胞中p-JNK和NF-κB p-p65的表达水平升高(图6h)。葛根素对M1型巨噬细胞极化的抗炎和抑制作用被SRT1460逆转，表明葛根素对抗巨噬细胞M1型极化的方式之一是通过抑制FoxO1转录活性。

图6 SRT1460激活Sirt1促进巨噬细胞M1型极化

随后，对JNK的活性进行了干预。用葛根素处理M1型巨噬细胞后，加入JNK激动剂茴香霉素(25 ng/ml)，检测相关指标的表达。在Raw264.7中，茴香霉素处理后p-JNK和JNK的表达水平显著升高(图7 a和图7 B)。接下来，分析了茴香霉素处理后巨噬细胞中M1极化指标和促炎因子的表达水平(图7 C-F)。我们观察到茴香霉素处理消除了葛根素对M1极化和促炎细胞因子释放的抑制作用。此外，茴香霉素处理显著增加了FoxO1的核定位(图7 G-I)。这些结果表明葛根素通过部分阻断JNK/FoxO1信号通路抑制巨噬细胞M1型极化和炎症反应。

图7 茴香霉素激活JNK/FoxO1信号通路促进巨噬细胞M1型极化

6. 葛根素靶向MyD88活性抑制下游信号激活

为了进一步研究葛根素与关键靶点之间的相互作用，采用分子对接研究来评估葛根素与其调节的蛋白之间的结合作用。葛根素与NF-κB p65、JNK、Foxo1、TLR4和MyD88蛋白的潜在相互作用如图8 A-G所示。黄色虚线表示氢键，并表示预测与葛根素相互作用的氨基酸残基。有趣的是，葛根素通过位于TIR结构域的SER-244, GLY-246, GLN-249和ARG-251残基与MyD88紧密结合(图8h)。与此一致的是，Co-IP实验证明葛根素通过减弱MyD88和TLR4之间的相互作用抑制了MyD88的活性，而不是MyD88的表达水平(图8i)。对TLR4(绿色荧光)和MyD88(红色荧光)的双重免疫标记进一步证明葛根素可以阻断它们的相互作用(图8j)。

图8 蛋白质结合模拟的示意图，包括葛根素结合NF-κB p65, JNK1, JNK2, JNK3, FoxO1, TLR4和MyD88

结论

葛根素可能通过调节MyD88抑制JNK/FoxO1和NF-κB通路的下游激活。这项研究强调了葛根素对肾脏损伤和功能障碍的有益影响。体内和体外实验均表明葛根素具有显著的抗炎活性。值得注意的是，葛根素通过抑制FoxO1和NF-κB p65活性来抑制M1转化和促炎物质的释放。Sirt1激动剂和JNK激动剂均可逆转葛根素对巨噬细胞M1型极化的抑制作用。

Hu Z, Chen D, Yan P, Zheng F, Zhu H, Yuan Z, Yang X, Zuo Y, Chen C, Lu H, Wu L, Lyu J, Bai Y. Puerarin suppresses macrophage M1 polarization to alleviate renal inflammatory injury through antagonizing TLR4/MyD88-mediated NF-κB p65 and JNK/FoxO1 activation. Phytomedicine. 2024 Sep;132:155813. doi: 10.1016/j.phymed.2024.155813.

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