疫苗前沿 | mRNA疫苗佐剂平台的开发

导读：IL-12 是一种由p40 和p35 亚基组成的异二聚体细胞因子，由单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞响应模式识别受体 （PRR） 信号传导产生。IL-12 通过 IL-12 受体发出信号，IL-12 受体由自然杀伤 （NK） 细胞和 T 细胞表达，在某些感染期间，IL-12 的产生会诱导这些细胞增殖并产生 IFN-γ。鉴于这些特性，IL-12 已被用作疫苗佐剂，以促进细胞介导的对各种寄生虫、细菌和病毒感染以及癌症的免疫。然而，一些研究表明，IL-12 驱动 CD8+ T 细胞分化为终末效应细胞不利于记忆 CD8+ T 细胞的形成。接种mRNA疫苗是否会诱导产生IL12，IL12又是否会影响mRNA疫苗触发的免疫反应，这些疑问尚不清楚。

2024 年 7 月 31 日，宾夕法尼亚大学Drew weissman团队在bioRxiv上传预印本文章：《An IL-12 mRNA-LNP adjuvant enhances mRNA vaccine induced CD8+ T cell responses》，他们评估了内源性 IL-12 在 mRNA 疫苗诱导的 CD8+ T 细胞反应中发挥的作用，并证实包含编码 IL-12 的 mRNA 可用于调节这些 CD8+ T 细胞群的规模和效应功能。

01

mRNA疫苗不会刺激内源IL-12产生

巨噬细胞是 IL-12 的主要来源，接种mRNA疫苗后，巨噬细胞会高效摄取mRNA-LNP ，并在引流淋巴结中被激活。C57BL/6 骨髓来源的巨噬细胞（1.5×105 个细胞/孔）与空 LNP（eLNP）、 mRNA （Ψ）- LNP 或mRNA（未修饰）- LNP 孵育 20 小时。mRNA（未修饰）- LNP分泌高水平的IFN-α，而 mRNA （Ψ）- LNP由于掺入修饰核苷酸，降低免疫原性，分泌的IFN-α明显降低。令人大为意外的是， mRNA （Ψ）- LNP 和mRNA（未修饰）- LNP居然都无法刺激巨噬细胞分泌 IL-12p40 。在小鼠模型中，肌肉注射mRNA （Ψ）- LNP 6h后，mRNA（未修饰）- LNP 可刺激小鼠引流淋巴结（腘窝和腹股沟）分泌IFN-α ，而对 IL-12p40 的分泌水平无任何影响。

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mRNA疫苗诱导CD8＋T细胞反应不需要IL-12

SIINFEKL是卵清蛋白 （OVA） 的免疫显性 CD8+ T 细胞表位，与MHC-I形成复合物，从而被OT-I CD8+T 细胞识别。将OT-I CD8+T 细胞移植到野生型 （WT） 或 IL12p40 缺陷型 （IL12p40-/-）小鼠体内，再用OVA-mRNA LNP免疫移植小鼠。在免疫后第 8 天和第 30 天，分析腹股沟和腘窝淋巴结 、脾脏和肺中 OT-I T 细胞的扩增、表型和功能。

缺失内源性IL-12并不会影响OT-I T 细胞扩增频率和数量。KLRG1（杀伤细胞凝集素样受体G1）和 CX3CR1 是高度分化的CD8+效应T细胞表面标记物。CXCR3 在活化的 T 淋巴细胞上高度表达，尤其是效应 T 细胞和记忆 T 细胞。CD127 高表达与长寿命记忆 T 细胞和记忆前体细胞有关。OVA-mRNA-LNP免疫野生型小鼠疫后，脾脏组织T细胞表型以KLRG1loCX3CR1loCXCR3hiCD127int主导，说明这些细胞并非效应T细胞，而是记忆前体T细胞。在WT或IL12p40-/-免疫小鼠中，OT-I T细胞在免疫后第8天或第30天时表面标记物表达没有差异。同样，IL-12 的缺失不会影响 OT-I T 细胞分泌IFN-γ 和 TNF-α 以及脱颗粒的能力（ CD107a ）。这些数据说明内源性IL-12似乎并非mRNA疫苗诱导 CD8+ T 细胞初始扩增、分化或获得效应功能的主要因素。

03

IL-12mRNA疫苗佐剂增强CD8＋T细胞反应

mRNA疫苗诱导CD8+ T 细胞反应不需要内源性 IL-12，那免疫接种时共注射外源IL-12 mRNA-LNP 对CD8+ T 细胞反应会产生怎么的影响呢？

将 WT 和 IL12p40-/- BMDM分别 与 IL12-mRNA LNP共同孵育，细胞内 IL-12 染色显示IL12-mRNA LNP诱导 IL12剂量依赖型分泌。在 mRNA疫苗免疫小鼠模型中，肌肉注射IL12-mRNA LNP，引流淋巴结中分泌的IL-12呈现剂量依赖，而且，在注射6h， IL12在引流淋巴结和血清中的浓度达到峰值3.5-4ng/mL，注射72h后又恢复到基础水平。

接下来，需要知道哪些细胞类型会产生 IL-12？用 5 μg LNP-OVA+IL12 或 LNP-OVA 免疫 IL12p40-/- 小鼠，16 小时后将来自 dLN 的细胞与蛋白质转运抑制剂（Brefeldin A 和 monensin）孵育 4 小时，然后染色表面标记物和细胞内细胞因子。结果显示，B细胞（CD19+）和淋巴细胞（CD90.2+）不表达IL-12，但在CD64+单核细胞（Ly6c+）、巨噬细胞（Ly6c）和cDCs中很容易检测到IL-12表达。

LNP-OVA 和或者LNP-OVA+IL12 免疫小鼠72h后，引流淋巴结中高表达CD64的巨噬细胞/单核细胞增加。共递送LNP-IL12 不会改变引流淋巴结中的 cDC 群体数量或 cDC1 和 cDC2 亚群的比例，但 PD-L1 和 CD64 标记分子( IFN-γ 信号传导经典靶标分子)的表达明显增加。CD64+ 巨噬细胞和 CD11c+DC细胞呈递 SIINFEKL-MHCI复合物比例最高的细胞。共递送LNP-IL-12不会影响抗原呈递细胞的数量或者组成，但这些抗原呈递细胞表面共刺激分子（CD80、CD86和CD40）的表达显著增强。

总结来说，mRNA疫苗免疫小鼠时，共注射IL12-mRNA-LNP会导致引流淋巴结中的IL12浓度增加，同时，伴随改变免疫细胞浸润、增强IFN-γ分泌，激活局部APC。

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IL-12mRNA疫苗佐剂增强CD8＋T细胞扩增

LNP-OVA或者LNP-OVA+IL12免疫移植WT OT-I T细胞的 C57BL/6 小鼠后，检测外周血中 OT-I CD8+ T 细胞比例。LNP-OVA+IL12 免疫小鼠使得外周血、引流淋巴结、肺部、脾脏中的OT-I CD8+ T 细胞扩增比例远超LNP-OVA 免疫组。

与LNP-OVA免疫小鼠相比，LNP-OVA+IL12免疫小鼠脾脏以及肺部的 OT-I CD8+ T 细胞表面标记分子的表达呈现更多的异质性，例如，CXCR3、CX3CR1、KLRG1、CD43和CD27。这种表达模式表明引入外源性的IL12虽然不会改变记忆前体T细胞数量（KLRG1loCX3CR1loCXCR3hiCD127int），但会触发提升更加终末分化的效应 QT-I T 细胞数量（CX3CR1+KLRG1+）。

在某些模型中，IL-12 促进 CD8+ 效应T细胞反应的能力可能不利于 CD8+ 记忆T 细胞库形成。当免疫时间超过4周后， OT-I CD8+ T 细胞数量出现明显减少，但是，LNP-OVA+IL12免疫小鼠要比LNP-OVA免疫小鼠拥有更多数量的OT-I CD8+ T 细胞。与免疫后第8天相比，在免疫后期，两组免疫小鼠的OT-I CD8+ T 细胞表型更加相似，以CD127+KLRGT-和CXCR3+CX3CR-为主。然而，LNP-QVA+IL12免疫组小鼠拥有更多数量的 CD27T细胞（一种与二次攻击时杀伤能力增加相关的表型）、中央记忆T细胞及效应记忆T细胞。此外，LNP-OVA+IL12免疫小鼠拥有更多数据的实质CD8+T细胞。总的来说，在mRNA疫苗免疫小鼠时，共递送IL-12 -mRNA LNP会显著增加各组织中CD8+记忆T细胞数量。

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IL-12mRNA-LNP增强CD8＋T细胞功能

在 OT-I CD8+ T 细胞移植小鼠模型中，LNP-OVA+IL12免疫小鼠脾脏要比LNP-OVA免疫小鼠拥有更高比例的 CD8+ T 细胞分泌IFN-γ。在体内细胞毒性 T 淋巴细胞 （CTL） 测定中，LNP-OVA免疫小鼠靶细胞杀伤能力为30%，而LNP-OVA+IL12免疫小鼠靶细胞杀伤能力达到66%。

在表达 OVA的李斯特菌株 （Lm-OVA）攻毒实验中，LNP-OVA+IL12免疫小鼠要比LNP-OVA表现出更强的免疫保护效应，而且，这种免疫保护效应与免疫小鼠外周血中 OVA 特异性 CD8+ T 细胞的比例呈正相关。LNP-OVA+IL12免疫小鼠，从1ug剂量降低至0.25 μg 后，仍然具有强烈的免疫保护作用。

在植入表达OVA（B16F0-OVA）的B16F0黑色素瘤细胞的小鼠模型中，与PBS对照组相比，LNP-OVA免疫组的肿瘤抑制能力很微弱，相反，LNP-OVA+IL12免疫组队在植入肿瘤后的30天持续保持高度的抑制能力。更加值得一提的是，单独注射LNP+IL12组也要比LNP-OVA免疫组表现出更加明显的肿瘤抑制能力。

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总结

IL-12 等促炎细胞因子的强效佐剂促使它们常常于增强治疗性免疫反应。本研究证实mRNA疫苗免疫机体后不会刺激巨噬细胞分泌IL-12，引流淋巴结中的IL-12水平在mRNA疫苗免疫后也不会发生显著变化。即便小鼠体内无法生成内源性IL-12，mRNA疫苗免疫小鼠后依然可触发CD8+T细胞正常的扩增、分化为效应T细胞。有意思的是，在mRNA疫苗中引入IL-12 mRNA，免疫机体后，引流淋巴结中的IL-12水平会发生瞬间增加，增强CD8+T细胞的扩增和效应功能，同时，还会提升记忆T细胞形成数量，从而使得mRNA疫苗具有更强的免疫保护作用。

多年来，如何触发高效的CD8+T细胞反应一直是疫苗设计的瓶颈。共递送编码细胞因子的mRNA增强疫苗触发的免疫反应的广度和深度，例如，使用一些影响抗体类别转换或 CD4+ T 细胞效应表型的细胞因子（例如 IL-4、IL-21）可能会带能更加高效的免疫保护。基于多年来细胞因子结构改造方面的研究，设计构建mRNA疫苗佐剂，可能会开发出更加持久有效的疫苗或者免疫治疗策略。

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撰写| 工程菌星球

校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea

编辑 设计| Alice