Nat Mater | 简化，高效，稳定且安全：利用自然胚泡微曲率逆转多能干细胞至初始态的创新细胞培养基材设计

在动物体内自然状态下，多能干细胞 （PSCs） 的初始态 （naive） 和始发态 （primed） 在着床前后胚胎中依次出现。这些状态下的PSCs在形态、克隆能力、转录组和表观遗传特征上不同。与始发态相比，初始态多能干细胞 （nPSCs） 表现出更广泛和更高的发育潜力，更强的增殖能力和更优的定向分化能力，尤其是在向胚外谱系分化方面。因此，在体外生成和稳定nPSCs对于类胚体/类器官生成、早期胚胎和疾病建模、个性化精准医学研究以及药物/疫苗开发具有重要意义。

nPSCs在胚泡中的存在极为短暂，且在培养容器中难以长期维持，因此获取nPSCs颇具挑战。尽管干细胞研究取得了长足进展，但体外primed-naive逆转、大规模培养和稳定nPSCs仍是生物医学转化应用中的一大障碍。传统的基因工程或特定的生长因子组合结合严苛的细胞培养条件 （例如低氧室和饲养细胞） ，能够一定程度解决问题，然而这些方法依然面临效率低，操作繁琐，成本昂贵等缺憾，且存在生物安全隐患。因此，亟需寻找一种稳健、可扩展、快速且安全的方法，以用于nPSC体外扩增，临床转化和治疗应用。

2024年8月12日，来自德国亥姆霍兹Hereon中心和柏林自由大学马楠教授团队的许逊博士在Nature Materials杂志上发表了文章Substrates mimicking the blastocyst geometry revert pluripotent stem cells to naivety，发现了一种利用具微米尺度曲率的培养基板将多能干细胞重置至初始状态的方法。该曲率参数来源于初始状态干细胞nPSCs的自然栖息地——胚泡内壁滋养层。作者提出了一种通过纯物理手段逆转多能干细胞至初始态的思路，旨在提高多能干细胞的质量、数量和应用潜力，并显著降低干细胞治疗和转化的成本，同时提高效率、保障安全性和稳定性。

无论在鼠还是人类胚泡中初始到始发态的变化不仅短暂, 伴随着细胞因子梯度和力学变化，而且包含明显的几何形态尤其是凹形曲面的消失或翻折。细胞培养器皿的表面几何特征被认为是影响细胞尤其是干细胞行为及分化命运的重要物理因素之一。作者设想通过抽取胚泡的关键曲面特性并将之赋予细胞培养基板表面来帮助逆转primed PSCs到naive状态。因此，理想的可用于筛选和验证曲率范围以及曲线方向性与PSCs逆转关联性的表面应具有符合胚泡内nPSCs所在滋养层界面 （Epiblast-trophectoderm interface） 曲率范围的曲面，并通过涵盖材料表面各点各个方向上胚泡相关曲率数量的随机分布，从三维水平反映胚泡曲率生物差异和多样性。此外，除必要曲面功能结构，细胞培养表面应提供足够的平整的nPSCs扩增空间。

为此，作者首先搜集了共聚焦显微镜摄制的小鼠胚泡E4.25-4.5天冠/矢状切面图，解析了小鼠胚泡中nPSCs与胚泡的凹形内侧滋养层接触界面的结构参数范围 （宽度、高度和曲率） 。将该界面胚泡尺度下 （胚泡半径：30 µm） 的曲率范围 （BSCR） 定义为一个二维定量参数。15至62 mm-1的BSCR值作为仿自然胚泡级微曲率的设计标准。考虑到三维水平上360度截面方向的曲率可变化性，作者将通过界面任意点与BSCR匹配的方向性曲线的数量定义为BSCR level。采用计算机辅助模拟和分析，将关键的拓扑几何特征整合到实际的细胞培养基板表面。最终的具有相关微结构的聚苯乙烯细胞培养界面则通过电火花加工 （火花侵蚀） 金属模具和注塑成型技术制备完成。作者使用从微型计算机断层扫描获得的细胞培养表面的体素数据集来映射其表面的空间信息，用于测量和计算基质上每个数据点周围18个独立方向上的曲率来界定BSCR level （这些点的径向距离设置为30 μm，以匹配胚泡半径；BSCR 1-18表示: 该数据点旋转360度后1个至18个方向符合BSCR） 。

通过表征整个培养基板表面每个像素点的曲率绝对值κ和18个方向曲率的平均值 〈κ〉，作者绘制了凹面 （〈κ〉≥2.5 mm-1） ，凸面 （〈κ〉≤-2.5 mm-1） ，相对平滑面 （-2.5 mm-1<〈κ〉< 2.5 mm-1） 和BSCR (κ=15~62 mm-1) 分布图。结合人工基板微结构特征识别，计算成像分析， 通过定制的Python编码，以及基于ImageJ的阈值处理和遮罩技术，实现图案识别、分割和量化分析。运用该方法绘制微结构曲率分布 （Concave， convex， flat， BSCR maps） 和初始干细胞的显微荧光图像 （NANOGhi， STELLAhi或GFPhi） 叠加位置图谱，从而将微型计算机断层扫描的基板材料表面数据和共聚焦激光显微镜细胞功能数据相关联。

基于这些图谱的原位分析，作者研究了局部微曲率对干细胞行为的影响，包括坏死、凋亡、增殖、细胞初始性和细胞内信号动态等。在微米尺度上深入了解几何特性如何影响干细胞行为以及多能干细胞如何在原位由始发态逆转到初始态。

动态活细胞追踪分析揭示了不同拓扑特征对primed-naive逆转的效率，并证明逆转在一天之内即可在BSCR区域发生，并且随着细胞的扩增和迁移，在BSCR曲率区域已逆转的细胞可以随意迁移并维持其naive状态而不被限制在BSCR曲率分布区域。此后能够在三至四天内使得nPSCs覆盖生长在基板表面的整个细胞群体。通过进一步的分析，作者发现即使在曲面结构中仅一个方向上的微米尺度曲率能够满足BSCR （BSCR 1） 也足以引发逆转。

鉴于小鼠和人类胚泡在着床进入primed状态前的滋养层界面高度结构相似性，作者将该培养基板直接应用于人类primed PSCs，同样的nPSCs重置效果仍可被观察到。

为同步化和最大化基板微结构特征，以便观察和获得最佳逆转效率，作者制备了统一曲率的微碗 （曲率各向同性） 和微槽 （各向异性） 结构基板。在统一或随机曲率的基板上，无论是各向同性还是异性的BSCR曲率分布，逆转效率都与BSCR水平的增加呈正相关。虽然在统一曲率基板上，72小时内的逆转效率不及具有随机微结构的基板，但nPSCs 的NANOG基因转录开启水平较随机基板的提升显著。

整体来看，BSCR的存在紧密压缩了细胞集落的顶部，其中的单个细胞呈现金字塔形，细胞头端收缩力增加， 肌球蛋白活化。BSCR通过增强E-cadherin介导的细胞-细胞相互作用，加强了细胞骨架结合的细胞间连接，YAP机械力感受效应蛋白的激活。这导致了组蛋白在相应naive基因相关启动子或增强子部位的H3K4me3修饰增加和相应基因表达的开启，细胞质内和胞核内的信号级联被激活，从而进一步触发表观遗传记忆。逆转的nPSCs在移除含有BSCR的基板并培养在普通细胞培养板平滑表面后至少能够维持十天集落形态、持续的E-cadherin和YAP水平。这些nPSCs在生成体外拟胚体和体内畸胎瘤方面表现出更高的三胚层发育潜力。

综上，受胚泡中nPSCs所处自然栖息地微结构的启发，通过跨学科的多模态图像关联研究，作者发现并验证了稳定获取鼠和人nPSCs的微曲面明确的结构参数和设计标准，即胚泡尺度曲率范围BSCR。该研究展示了无需严格的中心对称和具备单方向契合BSCR的曲率即可实现机械刺激响应相关的E-cadherin-YAP信号通路介导的表观遗传水平稳定逆转的物理方式，为nPSCs的体外大规模制备和长期维持提供新的简单、高效、稳定、经济和安全的思路。使nPSCs在未来基础细胞生物学研究以及潜在的制药和生物医学中的实际应用成为可能。

原文：

https://doi.org/10.1038/s41563-024-01971-4

制版人：十一

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