Nat Chem Biol丨尹胜/郭剑平团队揭示先导化合物DP通过靶向APOL2治疗肝纤维化的机制

肝纤维化是多种慢性肝病如病毒性肝炎、酒精/非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎以及胆汁淤积等不断进展最终导致肝脏功能障碍的一个重要病理过程，其特征为肝脏组织中肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSCs） 的激活和细胞外基质的过度沉积。肝纤维化持续进展最终将发展为肝硬化、肝癌等恶性疾病，严重威胁人类生命健康。到目前为止，尚未有针对肝纤维化的药物上市。因此，开发新型抗肝纤维化药物是亟待解决的临床问题。

2024年8月5日，中山大学药学院尹胜教授团队与附属第一医院郭剑平研究员团队合作在Nature Chemical Biology杂志在线发表了题为A natural small molecule alleviates liver fibrosis by targeting apolipoprotein L2的研究论文。该研究以抗肝纤维化活性为导向，对大戟科二萜类化合物库进行了高内涵筛选，获得一个在体内外具有强效抗肝纤维化活性的惕各烷型二萜小分子DP，通过化学生物学手段发现和证实其直接作用靶点为Apolipoprotein L2（APOL2），并首次揭示了APOL2为治疗肝纤维化的潜在新靶点。

通过高内涵筛选发现了一类强效抗HSCs激活的惕各烷型二萜 （5/7/6/3环系碳骨架） ，其中化合物DP为活性最优化合物。进一步研究发现，DP可以抑制TGF-1诱导的LX-2 （人肝星状细胞系） 和JS-1 （小鼠肝星状细胞系） 细胞激活，在低浓度下与阳性药物吡非尼酮 （Pirfenidone，PFD） 在高浓度下的效果相当。此外，DP可以抑制小鼠原代肝星状细胞自激活，以及抑制LX-2 3D细胞球中-平滑肌肌动蛋白 （-smooth muscle actin，-SMA） 的表达。以上结果表明DP是强效抗肝纤维化的先导化合物。

通过小鼠肝纤维化模型对DP进行体内药效学评价，结果显示口服给予DP可以剂量依赖性地减轻肝脏炎症浸润水平、肝细胞损伤水平和纤维化程度，且对小鼠的重要脏器和膝关节骨结构无明显毒性。值得注意的是，DP在20 mg/kg剂量下的治疗效果与PFD在200 mg/kg剂量下的治疗效果相当。表明DP是一个高活性且安全的先导化合物。

基于先导化合物DP合成了具有光亲和标记和点击化学反应基团的探针DP-PT（活性与DP相当） ，通过胶内荧光扫描、靶点垂钓、竞争性结合实验、体外蛋白结合实验、细胞热转移实验和荧光共定位分析证实DP的作用靶点为APOL2，且DP不与APOL1结合，表明DP具有一定的选择性。

通过APOL2片段化蛋白pull-down检测、光交联质谱分析、分子对接模拟和蛋白点突变验证实验，发现DP主要作用于APOL2蛋白的186−266 aa区域，其中N212和V216为关键氨基酸结合位点。

通过临床肝纤维化病人数据库、人体和动物肝脏中APOL2蛋白表达量分析，发现与正常肝脏组织相比，APOL2在纤维化肝脏组织中的表达量显著升高，且与疾病分期进展以及-SMA表达水平呈正相关关系。此外，通过特定细胞标记物与人类和小鼠纤维化肝脏组织中APOL2进行共染色实验，发现APOL2主要在活化的HSCs中高表达。通过调控LX-2细胞中APOL2表达实验发现，敲低APOL2能显著抑制TGF-1诱导的纤维化指标上调，而过表达APOL2能够在没有TGF-1刺激的情况下诱导纤维化指标上调。基于以上结果，利用CRISPR/Cas9技术构建了Apol2全身敲除 （Apol2-/-） 小鼠，并且在体内研究了Apol2敲除对肝纤维化的影响，结果显示Apol2敲除可以显著抑制CCl4诱导的小鼠肝纤维化进展，且无明显的器官毒性。以上结果表明APOL2与肝纤维化的发生发展密切相关，可以作为治疗肝纤维化的潜在靶点。进一步研究发现，DP在APOL2敲低的LX-2细胞中不能进一步降低纤维化水平，但可以抑制APOL2过表达引起的促纤维化效果。重要的是，与过表达APOL2WT （野生型APOL2） 相比，过表达APOL22A （N212和V216双突变的APOL2） 可以废除DP的抗纤维化活性。以上结果表明DP依赖于APOL2发挥抗肝纤维化功效。

初步机制研究发现DP处理或者敲低APOL2不影响经典的TGF-/Smad信号通路。通过免疫沉淀质谱、免疫荧光共定位、外源表达结合免疫沉淀实验，发现Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2 （SERCA2） ，一种内质网 （Endoplasmic reticulum，ER） 定位的Ca2+泵，可以与APOL2相互作用，且APOL2的N端负责与SERCA2结合。进一步研究发现，在TGF-1的刺激下，APOL2通过抑制SERCA2对ER Ca2+的螯合功能，进而激活PERK介导的ER应激通路。DP则可以靶向APOL2，阻断APOL2与SERCA2结合，恢复SERCA2的功能，抑制肝纤维化的发生。通过RNA-seq和基因调控实验，发现APOL2-ER应激的下游效应因子是HES1，且DP或APOL2敲低的抗纤维化作用是由HES1介导的。动物实验也显示DP给药或Apol2敲除可以抑制PERK-HES1信号通路。以上结果表明DP通过抑制APOL2-SERCA2-PERK-HES1轴发挥抗肝纤维化功效。

综上所述，该研究不仅鉴定DP为首个APOL2抑制剂，而且确认APOL2可以作为治疗肝纤维化的潜在新靶标。由于APOL2可能在其他器官纤维化以及其他疾病中发挥重要的调节作用，DP也可能成为未来基于APOL2的药物开发的有效工具。

https://doi.org/10.1038/s41589-024-01704-3

制版人：十一

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