《自然·通讯》原位喷涂的治疗性水凝胶用于氧激活的Janus调控术后肿瘤复发/转移和伤口愈合

摘要

手术是恶性黑色素瘤治疗的主要方式。然而，手术后恶化的低氧微环境被认为是肿瘤复发 / 转移和延迟伤口愈合的根本原因。在这里，作者设计并构建了一种可喷涂的治疗性水凝胶（ HIL@Z/P/H ），该水凝胶包含针对肿瘤的纳米药物和进行光合作用的蓝藻（PCC 7942），以防止肿瘤复发 / 转移的同时促进伤口愈合。在雌性小鼠的 B16F10 黑色素瘤术后模型中，纳米药物可以通过光动力治疗诱导的肿瘤细胞内级联反应破坏细胞的氧化还原平衡。此外，由 PCC 7942 光合生成的 O2 不仅可以增强氧化应激触发的细胞死亡，从而防止残留肿瘤细胞的局部复发，还可以阻断低氧诱导因子 1α 的信号通路，以抑制其远处转移。此外，持久的 O2 供应和 PCC 7942 分泌的细胞外囊泡可以共同促进血管生成和加速伤口愈合过程。综合来看，开发的 HIL@Z/P/H 在防止肿瘤复发 / 转移的同时促进伤口愈合，显示出在术后癌症治疗中的巨大应用潜力。

引言

手术是治疗黑色素瘤的主要治疗方式，黑色素瘤是皮肤癌中最致命和最易转移的恶性肿瘤。然而，由不完全手术切除引起的肿瘤复发和转移，导致超过 90% 的癌症死亡，这仍然是一个巨大的挑战。此外，手术后未愈合的伤口通常表现为大面积的皮肤缺损，常常在恢复阶段带来严重的术后痛苦。因此，有效防止肿瘤复发 / 转移和及时促进伤口愈合，以延长整体生存期和提高术后患者的生活质量，是当务之急。

临床辅助疗法包括化疗和放疗，通常与低特异性和严重的副作用相关。光动力治疗（ PDT ），在该治疗中，光激活的光敏剂将氧气（ O2 ）转化为反应性氧种（ ROS ），通过对细胞大分子造成氧化损伤来杀死肿瘤细胞，因其非侵入性和对健康组织的微小副作用，显示出特定局部肿瘤消融的巨大前景。然而，其治疗效果易受复杂的氧化还原平衡和肿瘤中介导的适应性抗药性的影响。有趣的是，一氧化氮（ NO ），作为参与多种生理过程的关键信号分子，已被发现通过加速细胞内谷胱甘肽（ GSH ）的分解，有效地破坏细胞的氧化还原平衡。此外， NO 与 ROS 高反应性生成更多高毒性的反应性氮种（ RNS ），这可以诱导强大的硝化应激触发的细胞死亡。虽然 ROS/NO/RNS 的抗肿瘤效果严重受限于它们相对较短的半衰期和有限的作用范围。因此，实现肿瘤细胞内智能和时空生成ROS/NO/RNS，以最大化其抗癌效果是至关重要的。由于肿瘤细胞快速增殖导致的氧供应受损和氧需求增加之间的不平衡，低氧是肿瘤微环境中最普遍的特征之一。它不仅不利地影响 PDT 的治疗效果，而且显著激活低氧诱导因子 1α （ HIF-1α ）的表达，该因子调节肿瘤转移的多个关键步骤。伤口愈合是一个动态且复杂的过程，包括止血、胶原蛋白合成、血管生成和上皮化，每个步骤都依赖于足够的氧供应。而手术后伤口的缺血引起的低氧微环境严重延迟了伤口愈合过程。尽管已经开发了各种方法来解决这个问题，但构建一个持久的 O2 供应系统仍然是一个巨大的挑战。藻类微生物，由于其原始的光能合成系统，被认为是地球上主要的 O2 供应者，可能被探索为缓解低氧的理想氧气生成器。

在这项工作中，作者开发了一种治疗性水凝胶，以防止肿瘤复发 / 转移并在切除后促进伤口愈合。为获得针对肿瘤的纳米药物（称为 HIL@Z ），将靛青绿（ ICG ）和 L- 精氨酸（ L-Arg ）加载到沸石咪唑框架（ ZIF-8 ）纳米粒子中，然后用透明质酸（ HA ）进行涂层。由于其高载荷能力、定制的孔径、易于制备和独特的 pH 响应性生物降解性，选择 ZIF-8 作为合适的载体。然后在手术部位原位构建含有 HIL@Z 纳米药物和光合蓝藻（ PCC 7942 ）的喷雾型海藻酸钙水凝胶（称为 HIL@Z/P/H ）。在肿瘤细胞内选择性内化和pH响应性解离后，释放的ICG和L-Arg能在近红外激光（808 nm）下通过PDT诱导的级联反应产生ROS、NO和RNS，从而通过同时增加细胞内反应性物质和减少 GSH 破坏细胞的氧化还原平衡。更重要的是，通过红激光（635 nm）下PCC 7942的光合作用持续产生大量O2，以缓解低氧微环境，预期具有多重功能，包括 i) 有效增强 PDT 诱导的硝化应激触发的残留肿瘤细胞的细胞死亡，以防止其局部复发。 ii) 显著阻断细胞内 HIF-1α 信号通路，以抑制远处肿瘤转移。 iii) 在 PCC 7942 分泌的细胞外囊泡（ EVs ）的帮助下，有效上调血管内皮生长因子（ VEGF ），从而促进血管生成和手术后伤口的愈合过程。因此，能够防止肿瘤复发 / 转移并促进伤口愈合的喷雾型 HIL@Z/P/H ，对术后癌症治疗具有巨大的应用前景。

结果

HIL@Z纳米药物的制备和表征

通过简单的一锅自组装策略，通过 Zn2+ 和 2- 甲基咪唑（ 2-MIM ）之间的配位，实现了 ICG 和 L-Arg 在 ZIF-8 中的原位封装，随后涂覆透明质酸（ HA ）。选择 ICG 和 L-Arg 的组合是因为它可能会破坏肿瘤细胞的细胞氧化还原平衡。一方面， PDT 产生的 ROS 可以催化 L-Arg 生成NO，通过下调细胞内 GSH 水平来增强 PDT 的敏感性。另一方面，NO与ROS具有高反应性，生成更多活性强且有毒的 RNS ，从而通过增强细胞内生物分子的氧化损伤，诱导强烈的硝化应激触发细胞死亡。 HA 涂层可以赋予纳米粒子对癌细胞的主动靶向能力，这可以有效减轻对正常细胞的副作用并克服 ROS/NO/RNS 的短半衰期，从而大大增强其对肿瘤细胞的治疗效果。扫描电子显微镜（ SEM ）和透射电子显微镜（ TEM ）图像显示 ZIF-8 、 IL@Z 和 HIL@Z 纳米粒子均呈球形形态（图 2a 、 b 及补充图 1 ）。此外，元素映射结果显示 C 、 O 、 N 、 Zn 和 S 在 HIL@Z 中均匀分布，表明 ICG 和 L-Arg 的成功封装（图 2c ）。在封装 ICG/L-Arg 并涂覆 HA 后，平均流体动力学直径从 150 纳米增加到 190 纳米和 218 纳米，而 zeta 电位分别从 +25.5 mV 降低到 +14.2 mV 和 -22.3 mV （图 2d 、 e ）。已报道 Zn 2+ 可以分别与 ICG 的磺酸基团和 L-Arg 的胍基团配位。因此， ICG 和 L-Arg 将参与 ZIF-8 的结晶过程，从而导致更大的颗粒大小。 zeta 电位的明显反转主要是由 HA 的固有负电荷引起的。利用紫外 - 可见（ UV-vis ）光谱进一步验证了 ICG 的掺入。如图 2f 所示，在自由 ICG 的 UV-vis 光谱中， 715 纳米和 780 纳米处出现了特征吸收峰。对于 HIL@Z 纳米粒子，典型峰值分别位于 745 纳米和 825 纳米。红移现象表明形成了 ICG 寡聚体，这可能是由 ICG 与 ZIF-8 骨架或 ICG 分子之间的相互作用引起的。与 ZIF-8 的傅里叶变换红外光谱（ FT-IR ）光谱相比， HIL@Z 的光谱中出现了 1089 cm −1 、 1475 cm −1 和 1629 cm −1 的新吸收带，分别对应于 ICG 的乙烯伸缩、 L-Arg 的 C═N 伸缩振动和 HA 的 C═O 伸缩（图 2g ）。这些结果进一步验证了 ICG/L-Arg 的成功加载和 HA 的功能化。此外， X 射线衍射（ XRD ）图谱显示， HIL@Z 和纯 ZIF-8 具有相似的晶体特征峰， 2θ 值为 7.28 、 10.36 、 12.71 和 18.02 ，表明封装 ICG/L-Arg 和涂覆 HA 的 ZIF-8 宿主的结晶性几乎未受影响（图 2h ）。接下来，根据热重分析（ TGA ）结果估算， HIL@Z 纳米粒子中 ICG 、 L-Arg 和 HA 的含量分别约为 7.4% 、 6.9% 和 17.3% （补充图 2 ）。然后评估了 HIL@Z 纳米粒子的稳定性。结果显示，在含有 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基（ pH = 7.4 ）和磷酸盐缓冲盐水（ PBS ）（ pH = 7.4 ）中， HIL@Z 纳米粒子的流体动力学尺寸和多分散性指数在一周存储后保持不变，说明 HIL@Z 具有良好的稳定性（补充图 3 ）。随后，研究了 HIL@Z 纳米粒子的 pH 响应性。结果显示， HIL@Z 在中性 pH 7.4 时保持了良好的球形结构，而在轻微酸性 pH 5.5 时分解成小碎片（补充图 4 ）。动态光散射（ DLS ）结果显示，纳米粒子在 pH = 7.4 时的流体动力学尺寸保持不变，而在 pH = 5.5 时显著改变，进一步表明 HIL@Z 结构在酸性条件下的解体（补充图 5 ）。然后确定了 HIL@Z 的 ICG 释放行为，借助绘制的标准曲线（补充图 6 ）。如图 2i 所示，在中性（ pH = 7.4 ）和酸性（ pH = 5.5 ）溶液中分别释放了 6.8% 和 79.8% 的药物，表明ZIF-8宿主具有优异的pH响应性。

1,3- 二苯基异苯并呋喃（ DPBF ）被用来表征HIL@Z的ROS生成能力，因为在单线态氧（ 1 O2 ）存在下，其在 410 纳米处的吸收强度会不可逆地减弱。如图 2j 和补充图 7 所示，一旦暴露于 808 纳米的辐射， DPBF 溶液的吸收强度急剧下降。此外，近红外辐射功率越高， DPBF 的吸收强度下降得越快。经过 808 纳米辐射（ 1.5 瓦 / 平方厘米） 10 分钟后，大约 76.5% 的 DPBF 被消耗。所有这些结果都表明， HIL@Z 纳米粒子在近红外激光下具有良好的 ROS 生成能力。然后使用 Griess 试剂检查 HIL@Z 经过光动力治疗（ PDT ）后的 NO 生成性能。基于补充图 8 中的标准曲线确定了 NO 的浓度。发现 NO 的产生严重依赖于近红外辐射，经过近红外激光辐射（ 1.5 瓦 / 平方厘米） 10 分钟后， NO 的浓度达到了 5.8 微摩尔（图 2k ）。理论上，生成的 NO 可以进一步与 ROS 反应产生过氧亚硝酸盐（ ONOO- ），它比 ROS 和 NO 更具细胞毒性。并且使用二氢罗丹明 123 （ DHR ）作为特定的 ONOO- 探针来评估 ONOO- 的产生。如图 2l 所示， DHR 在 DHR+HIL@Z 组中的荧光几乎没有变化，而随着近红外辐射时间的延长，其明显增加（补充图 9 ）。向 DHR+HIL@Z 组中引入维生素 C （ Vc ）导致荧光显著减少，基本与 DHR 单独使用时相同。这很容易理解，因为 Vc 会迅速清除生成的 ONOO- 。所有这些结果直接证明了通过ROS和NO的级联反应产生了ONOO-。

HIL@Z/P/H的制备和表征

PCC 7942 细胞呈杆状，宽度为 0.6-1.2 微米，平均长度为 3.0-8.0 微米，并且在 558 纳米的激发下显示出强烈的红色荧光，这是由于它们内部丰富的叶绿素（补充图 10 ）。可以发现，浑浊的培养液显示出特征性的绿色（补充图 11a 的插图），这是由于指数生长期（ OD680 = 0.8-1.2 ）内细胞内叶绿素分子的浓缩（补充图 11a ）。如补充图 11b 所示， PCC 7942 的吸收光谱显示在 440 、 630 和 681 纳米处有三个强峰，表明存在叶绿素 a 。然后在 PCC 7942 的标准曲线的帮助下确定了 PCC 7942 的数量（补充图 11c ）。随后，研究了在635纳米激光辐射下蓝藻的O2产生能力。如补充图 12 所示， O2 产生率与激光功率密度和 PCC 7942 的浓度在一定范围内呈正相关。根据上述结果，选择 1.0 瓦 / 平方厘米和 8.6 × 10^8/mL 作为最佳激光功率密度和蓝藻浓度。

通过同时喷涂等体积的 CaCl2 溶液和包含 HIL@Z 纳米药物及 PCC 7942 的海藻酸盐溶液，制备了 HIL@Z/P/H 。数字照片证明了不同水凝胶的成功制备，通过瓶翻转试验证明（图 3a ）。此外，流变试验结果显示，水凝胶和 HIL@Z/P/H 的储存模量（ G' ）始终大于它们的损失模量（ G" ），进一步表明它们的水凝胶特性（补充图 13 ）。另外，高放大倍率的伪彩色 SEM 图像显示， HIL@Z 纳米粒子（蓝色）和 PCC 7942 （绿色）在 HIL@Z/P/H 的微孔网络结构中均匀分布（图 3b ）。并且水凝胶的形态几乎不受 PCC 7942 的影响（补充图 14 ）。元素映射图像显示 HIL@Z/P/H 中存在 C 、 O 、 N 和 Zn ，其中 Zn 来源于 HIL@Z 纳米粒子， C 、 O 和 N 主要归因于水凝胶（图 3c ）。此外， HIL@Z/P/H 显示出 ICG 的 pH 响应性释放和有效的光动力效果（补充图 15 和补充图 16 ）。所有这些结果进一步验证了HIL@Z纳米粒子在HIL@Z/P/H中的成功封装。同时，荧光图像进一步表明了 PCC 7942 在 HIL@Z/P/H 中的成功封装，证据是红色自荧光 PCC 7942 的均匀分布（图 3d ）。

接下来，系统研究了 HIL@Z/P/H 中 PCC 7942 的生物活性和光合稳定性。结果显示，在不同天数储存后， P/H 的 OD680 值和外观没有明显差异（补充图 17 和补充图 18 ）。此外，不同天数储存后从 P/H 中获得的 PCC 7942 均生长良好，菌落数量没有明显差异（补充图 19 ）。另外， HIL@Z/P/H 的光合行为在储存 15 天后几乎没有明显恶化（图 3e ）。并且在重复激光开关循环测试中， HIL@Z/P/H 仍能产生相同数量的 O2 （图 3f ）。所有这些结果都表明，封装在HIL@Z/P/H中的PCC 7942具有满意的光合O2生成稳定性。

体外细胞吞噬和细胞氧化

为证明HA的细胞靶向能力，将罗丹明 B （ Rhm B ）作为 ICG 的替代品加载到 ZIF-8 中，以监测 HBL@Z 纳米粒子的细胞摄取行为。如图 4a 所示，经 HBL@Z 纳米粒子处理的 B16F10 细胞显示出的荧光强度明显高于与 BL@Z 纳米粒子孵育的细胞，表明 HBL@Z 纳米粒子的 CD44 依赖性细胞摄取。此外，通过在添加 HBL@Z 纳米粒子之前先用自由 HA 孵育 B16F10 细胞 1.5 小时进行竞争性抑制实验。结果显示，细胞内荧光强度与 BL@Z 组相似，远低于 HBL@Z 组。这很容易理解，因为 CD44 受体被过量的自由 HA 阻塞。此外，定量流式细胞仪分析细胞内 Rhm B 信号的结果显示相似结果，即 HBL@Z 的摄取量是 BL@Z 的两倍（图 4b, c ）。相比之下，用 HBL@Z 处理的人脐静脉内皮细胞（ HUVECs ）显示出弱的红色荧光，不同处理组之间的荧光强度差异很小，表明由于 HUVECs 上没有表达 CD44 ，因此很少有纳米粒子被 HUVECs 摄取（补充图 20 ）。这些结果进一步验证了 HA 在介导 HBL@Z 细胞摄取中的重要作用。接着研究了 HIL@Z 的溶酶体逃逸行为。如图 4d-g 所示，在孵育 2.5 小时后， HIL@Z 的红色荧光与溶酶体的绿色荧光大部分重叠，而在 4 小时时重叠区域的红色荧光信号迅速减少，并在细胞质中增加。这些结果不仅再次验证了 HIL@Z 纳米粒子的特异性靶向作用，还表明它们成功地从溶酶体逃逸。

为了评估光合PCC 7942是否能够缓解细胞内低氧微环境，通过细胞内低氧指示剂 Ru(dpp)3Cl2 来可视化 O2 产生，该指示剂的荧光可以被 O2 猝灭。具体来说， B16F10 细胞在与 P/H 孵育前先被剥夺 O212 小时，然后通过测量 Ru(dpp)3Cl2 的荧光强度来监测细胞内 O2 水平。如图 4h, i 所示，在对照组、红光组和 P/H 组的肿瘤细胞中观察到强烈的红色荧光，显示它们在剥夺 O2 后的 p O2 值相对较低。而在 P/H+ 红光处理后，肿瘤细胞的荧光强度显著降低，表明有效的体外氧合。众所周知，低氧可以有效激活 HIF-1α 信号通路，该通路影响肿瘤转移的多个步骤。为了验证光合 O2 产生的 PCC 7942 是否在体外抑制 HIF-1α 信号通路，对不同处理后的细胞裂解物进行了 WB 和 RT-qPCR 分析。如图 4j, k 所示，在所有组别中， P/H+ 红光组的 B16F10 细胞显示出最低的 HIF-1α 蛋白和 HIF-1α mRNA 表达水平。此外， HIF-1α 依赖性基因的蛋白表达水平，如 MMP-9 、 EPO 、 HO-1 、 ADM 和 Glut-1 ，在缓解低氧后也同时下调（图 4j 和补充图 21 ）。所有这些结果都表明， PCC 7942 的体外氧合不仅可以缓解细胞内低氧微环境，还可以有效阻断与黑色素瘤转移密切相关的 HIF-1α 依赖性基因的上游通路。

体外抗癌活性

系统研究了HIL@Z/P/H对B16F10细胞的体外抗癌活性。首先 ， 使用 alamar blue 试验和活 / 死染色评估了 HIL@Z 纳米粒子、 PCC 7942 和 HIL@Z/P/H 对 HUVECs 和 B16F10 细胞的细胞毒性。经过 24 小时孵育后， HUVECs 和 B16F10 细胞的存活率几乎高于 90% ，表明所有样品具有良好的细胞兼容性（图 5a 和补充图 22-24 ）。在确认 HIL@Z/P/H 具有良好的生物相容性后，检测了 HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 辐照的体外抗癌活性。结果显示， HIL@Z/P/H+NIR 组的肿瘤细胞存活率降至约 33.4% ，显著低于其他组（图 5b ）。此外， HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 组的肿瘤细胞存活率最低（ 19.0% ），表明 PCC 7942 的氧合效应可以有效提高细胞杀伤效率。上述结果通过活 / 死染色荧光图像进一步证实（图 5c ）。定量流式细胞术结果（分选策略见补充图 25 ）表明， HIL@Z/P/H+NIR 组的总凋亡比例（ 65.69% ）远高于对照组（ 1.24% ）和红光 +NIR 组（ 6.50% ），表明其优异的诱导凋亡特性（图 5d, e ）。此外，由 HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 处理的癌细胞的晚期凋亡比例（ 66.76% ）和坏死比例（ 4.19% ）显著高于 HIL@Z/P/H+NIR 组（分别为 55.07% 和 0.35% ），进一步验证了产生的 O2 增强了癌细胞的凋亡。流式细胞分析与 alamar blue 试验和活 / 死染色的结果一致，表明ICG/L-Arg和光合生成的O2对整体抗癌活性的协同效应。

为了揭示 HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 的抗癌机制，通过 2',7'- 二氯荧光素二乙酸酯（ DCFH-DA ）、 3- 氨基 -4- 氨甲基 -2',7'- 二氟荧光素二乙酸酯（ DAF-FM DA ）和 DHR 分别评估了不同组细胞内 ROS 、 NO 和 ONOO– 的水平。如图 5f 所示，在 B16F10 细胞经 HIL@Z/P/H+NIR 处理后，可以观察到强烈的 ROS 、 NO 和 ONOO– 的绿色荧光，表明它们在细胞内有效生成。有趣的是， HIL@Z/P/H+NIR 处理细胞中 DCFH-DA 的荧光强度略弱于 HI@Z/P/H+NIR 处理细胞。这很容易理解，因为如上所述，光动力治疗产生的 ROS 可以与 L-Arg 反应产生 NO 和 ONOO– 。值得注意的是， HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 组 B16F10 细胞显示的荧光强度比 HIL@Z/P/H+NIR 组更强，进一步确认了在光合生成的 O2 帮助下 ROS 、 NO 和 ONOO– 水平的进一步增加。通过流式细胞术进一步定量确定了细胞内 ROS 、 NO 和 ONOO– 的生成，其结果与荧光显微镜的结果一致（图 5g–l ）。为了确定 HIL@Z/P/H 在癌细胞内耗尽 GSH 的能力，使用 ThiolTracker Violet 荧光染料来可视化细胞内 GSH 。结果显示，与其他组相比， HIL@Z/P/H+NIR 处理后细胞内 GSH 水平急剧降低（补充图 26 ）。当应用红激光辐照时，绿色荧光几乎消失，表明其在清除细胞内 GSH 方面具有极佳的能力。所有这些结果都揭示了 HIL@Z/P/H 的光合氧合效应能有效促进 ROS/NO/ONOO– 的产生和 GSH 耗尽，从而破坏氧化还原平衡并增强抗癌效果。

体内肿瘤复发/转移抑制和伤口愈合促进的瘤切除模型

然后建立不完全肿瘤切除模型，以进一步研究 HIL@Z/P/H 对残留肿瘤细胞局部复发的抑制效果。当肿瘤生长到约 100 mm³ 时，约 95% 的肿瘤被外科切除，并且外科切除床同时用含 HIL@Z 纳米粒子和 PCC 7942 的 CaCl2 溶液和海藻酸盐溶液通过双筒喷雾器喷洒。然后在第 1 、 3 和 5 天对刚制备的 HIL@Z/P/H 分别应用红激光（ 635 纳米， 1.0 瓦 / 平方厘米， 30 分钟）和近红外光（ 808 纳米， 1.5 瓦 / 平方厘米， 10 分钟）进行肿瘤治疗（图 6a ）。记录伤口愈合过程，并在 14 天内同时监测肿瘤大小的时间依赖性变化。发现 HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 组的伤口逐渐闭合，并在第 14 天完全愈合，而所有其他组的伤口几乎未愈合，明显有痂皮形成（图 6b ）。此外， HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 组显示出更好的伤口收缩效果和较小的未闭合伤口面积，进一步验证了其出色的促进伤口愈合活性（补充图 27 ）。 HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 组中的肿瘤显著缩小，而其他七组的肿瘤生长率持续不受控制地增加。更重要的是， HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 组中的一些肿瘤甚至在没有复发的情况下消失（图 6c–e ）。此外，得益于出色的肿瘤抑制效果， HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 组的小鼠在 42 天内显示出显著延长的寿命，并显示出最高的存活率（ 80% ）（图 6f ）。

为了进一步研究HIL@Z/P/H的体内治疗效果，采用了典型的苏木精 - 伊红（ H&E ）染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记（ TUNEL ）、 Ki67 染色和 HIF-1α 免疫组化染色（图 6g ）。 H&E 染色结果显示， HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 组中的大多数细胞表现出核破裂和不完整的细胞结构，而其他七组的肿瘤组织则显示出完整的结构和完整的细胞核。 TUNEL 实验显示， HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 组的肿瘤细胞比其他七组显示更高的凋亡率。此外， Ki67 表达的最大抑制也观察到在 HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 组中，表明肿瘤细胞的增殖显著减少。不同组之间的显著差异可以通过定量分析进一步验证（图 6h, i ）。所有这些结果表明， HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 处理能有效抑制肿瘤生长，通过诱导肿瘤细胞的混合性坏死 / 凋亡并抑制其体内增殖。为了揭示其潜在机制，进行了体内 ROS 、 NO 和 RNS 的检测。与体外特性一致， HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 治疗组的荧光强度显示 ROS/NO/RNS 水平明显高于其他组（补充图 28 ）。这进一步验证了光合氧合能有效促进 ROS 的生成和随后的 NO 和 RNS 的产生，从而增强 PDT 诱导的硝化应激触发的残留肿瘤细胞死亡，防止其局部复发。此外，进行了 HIF-1α 免疫染色，以评估不同组肿瘤的体内低氧条件（图 6g ）。 HI@Z/P/H+NIR 和 HIL@Z/P/H+NIR 组的肿瘤组织显示出略高于对照组的 HIF-1α 表达，显示了由 PDT 消耗 O2 引起的低氧程度加剧。有趣的是，在 HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 组中几乎观察不到肿瘤组织的 HIF-1α 阳性染色（棕色），这主要归因于 PCC 7942 对肿瘤的 O2 补充。此外，通过检测 MMP-9 和 HIF-1α 的表达水平，进一步验证了 O2 对转移的抑制能力。如图 6j 和补充图 29 所示，与对照组相比， HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 治疗显著降低了 HIF-1α （约 60% ）和 MMP-9 （约 80% ）的表达，表明 PCC 7942 的良好 O2 补充和缓解低氧能力。这些体内结果与体外实验（图 4j, k ）相符，提供了强有力的证据表明， HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 治疗可能通过下调 HIF-1α 和 MMP-9 的水平来缓解肿瘤低氧，抑制肺转移。然后通过研究肺部的转移结节来研究 HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 治疗的抑制转移效果。如图 6k 和补充图 30 所示， HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 组的小鼠肺部没有明显的肺转移结节，表明 HIL@Z/P/H+ 红光 +NIR 治疗能有效抑制肿瘤转移。相比之下，其他组的小鼠肺部发现了明显的转移结节。此外， HIL@Z/P/H+NIR 组显示出几个转移灶，表明 O2 而非反应性物种（ ROS 、 NO 和 RNS ）在抑制黑色素瘤中的转移中起关键作用。值得注意的是，已发现 O2 能有效激活抗肿瘤免疫反应。作者进行了巨噬细胞和 CD8 T 细胞渗透到肿瘤中的免疫荧光分析。如补充图 31 所示，治疗后的小鼠中检测到最高百分比的 F4/80 和 CD3CD8 细胞，提供了肿瘤微环境的变化，包括硝化应激触发的细胞死亡和缓解低氧促进了巨噬细胞和细胞毒性 T 细胞的渗透的证据。此外，在评估期间，所有小鼠的体重显示出不显著的波动（补充图 32 ）。此外，对照组和治疗组小鼠之间在溶血率、血凝指数（ BCI ）、血液生化和血液指标方面没有显著差异（补充图 33 和补充图 34 ）。并且没有发现主要器官（心脏、肝脏、脾脏和肾脏）的组织结构中有毒性迹象（补充图 35 ）。所有这些结果表明 HIL@Z/P/H 在体内相对安全。

P/H在体外促进血管生成

血管生成对于通过血液供应为细胞提供营养和氧气从而促进伤口愈合至关重要。长期低氧被证明是血管生成最强有力的诱因之一。此外，有报道称 PCC 7942 分泌的细胞外囊泡（ EVs ）能够通过上调白细胞介素 6 （ IL-6 ）的表达促进血管生成和加速皮肤伤口愈合。在作者的研究中，预期 P/H 通过光合作用有效补充足够的氧气，以逆转术后伤口的低氧状态（图 7a ）。为了验证这一点，首先对 PCC 7942 分泌的 EVs 进行了表征。如图 7b 、 c 所示， PCC 7942 分泌的 EVs 显示出球形形态，直径为 120-290 纳米，与先前报道的相似。然后通过体外细胞实验系统地研究了 P/H+ 红光处理对皮肤组织再生的刺激效果，如成纤维细胞增殖、划痕愈合和管形成实验。选择人脐静脉内皮细胞（ HUVECs ）和 L929 小鼠成纤维细胞作为模型细胞，因为它们在伤口愈合过程增殖阶段的血管化和上皮化中起关键作用。 alamar 蓝实验显示，经 P/H+ 红光处理的 HUVECs 的活性高于对照组（补充图 36 ）。值得注意的是， P/H+ 红光处理后 L929 细胞的活性比 P/H 组提高了约 40% ，表明 PCC 7942 产生的氧气通过促进成纤维细胞的增殖具有显著的肉芽组织潜力（补充图 37 ）。所有这些结果表明，产生的氧气对 HUVECs 和 L929 细胞具有良好的细胞增殖活性。据报道， PCC 7942 分泌的 EVs 还通过上调 IL-6 的表达促进血管生成和伤口愈合， IL-6 在招募白细胞、促进血管生成和增加胶原沉积的过程中起着至关重要的作用。为了验证 PCC 7942 分泌的 EVs 是否能上调 IL-6 表达，进行了 RT-qPCR 分析以评估 HUVECs 和 L929 细胞中的 IL-6 mRNA 表达。结果显示， P/H 组中的 IL-6 水平比 P/H+GW4869 组提高了约 60% ，进一步验证了 IL-6 水平的上调可能是 PCC 7942 分泌的 EVs 促进伤口愈合活性的原因（补充图 38 ）。

接下来，通过划痕实验检测了 P/H+Red 处理对细胞迁移的促进效果，这是一种模拟伤口愈合过程的标准体外技术。如图 7d 所示， P/H+Red 组的划痕在 24 小时后几乎消失。定量分析表明， P/H+Red 组 HUVECs 的迁移比率（约 67.4% ）几乎是对照组的两倍（约 36.7% ），确认光合产生的 O2 能有效加速 HUVECs 的迁移（图 7e ）。值得注意的是， P/H+GW4869 组的迁移比率（约 42.5% ）明显低于 P/H 组（约 60.1% ），强烈表明 PCC 7942 分泌的 EVs 能有效增强内皮细胞的迁移。此外，通过 Matrigel 管形成实验评估了 HUVECs 的血管形成性能。如图 7f–h 所示，对照组的管数量约为 8 ， P/H 组显著增加到约 26 ，并在 P/H+Red 组达到最高（约 61 ）。类似地，节点数从对照组的约 23 增加到 P/H 组的约 86 和 P/H+Red 组的约 176 。与 P/H 组相比，添加 GW4869 后，管和节点的总数减少了约 50% ，表明 PCC 7942 分泌的 EVs 赋予了水凝胶促进血管形成的生物活性。总体而言，这些结果表明 PCC 7942 产生的 O2 和 EVs 具有良好的细胞血管生成能力。

体内全层皮肤缺损愈合

基于体外生动的血管生成结果，进一步研究了HIL@Z/P/H在体内促进伤口愈合的作用（图 8a ）。为了排除肿瘤生长对伤口愈合的负面影响，在 C57BL/6 小鼠的背部建立了圆形全层皮肤缺损（平均直径 8 毫米）。随后，当 CaCl2 溶液和含 HIL@Z 纳米药物 /PCC 7942 的海藻酸盐溶液同时在术后腔内喷洒时，获得了即时和超快的原位凝胶化（约 5 秒）（补充电影 1 ）。并对 12 天内的伤口愈合过程进行了监测。直观图像显示， P/H+Red 和 HIL@Z/P/H+Red 处理后的伤口愈合率远高于其他组（图 8b, c ）。可以看到， P/H+Red 和 HIL@Z/P/H+Red 组在伤后第 3 天（早期阶段）的伤口闭合率甚至增加到约 62.4% ，明显高于其他组。第 12 天时，对照组、水凝胶组、 P/H 组和 P/H+GW4869 组的剩余伤口面积分别为约 19.3% 、 16.4% 、 6.3% 和 17.8% 。而 P/H+Red 和 HIL@Z/P/H+Red 组的伤口在第 12 天几乎完全愈合，其伤口闭合率高达约 99.3% 和 98.9% （图 8d, e 和补充图 39 ）。此外， PCC/H+Red 和 HIL@Z/P/H+Red 组的皮肤组织由正常结构的规则毛细血管网络组成，与其他组的不完整血管结构完全不同（补充图 40 ）。所有这些结果表明， PCC 7942 产生的 O2 和 EVs 通过促进血管再生，有效地推动了伤口愈合。

组织学分析进一步研究了伤口愈合过程。在苏木精 - 伊红（ H&E ）染色结果中可以看到，第 3 天时， P/H 、 P/H+Red 和 HIL@Z/P/H+Red 组的切片边缘已形成重建的上皮，而对照组、水凝胶组和 P/H+GW4869 组在第 7 天时几乎观察不到新表皮（补充图 41 ）。到了第 12 天 ， P/H+Red 和 HIL@Z/P/H+Red 组的伤口显示出完全连接且较厚的新表皮 （ 图 8f, g ） 。此外， P/H+Red 和 HIL@Z/P/H+Red 组的伤口中可以观察到新的毛囊。此外， P/H+Red 和 HIL@Z/P/H+Red 组在第 3 、 7 和 12 天的伤口中的胶原沉积量始终至少是对照组和水凝胶组的两倍（图 8h, i 和补充图 42 ）。这些结果表明， HIL@Z/P/H 能够有效促进体内伤口愈合，通过同时增强新表皮生长和胶原沉积。

为了进一步揭示 PCC 7942 含有的水凝胶增强伤口愈合的潜在机制，进行了 HIF-1α 、 VEGF 、 CD31 和 α-SMA 的免疫组化染色，以研究皮肤新血管生成。由于低氧可能损害修复细胞的增殖和激活各种生长因子。首先确定 HIF-1α 的免疫组化染色，以评估肉芽组织中的低氧程度。发现 P/H+Red 和 HIL@Z/P/H+Red 组的 HIF-1α 阳性区域大约是其他组的一半，显示 PCC 7942 通过光合作用产生的 O2 可以通过补充溶解的 O2 到伤口床来缓解低氧，从而促进愈合过程（图 9a, e 和补充图 43 ）。为了验证低氧缓解是否可以激活各种促血管生成的生长因子，选择 VEGF 、 CD31 和 α-SMA 进行免疫组化染色分析，这些通常代表伤口血管生成水平。可以看到， P/H+Red 和 HIL@Z/P/H+Red 组的相对 VEGF 表达和 CD31 阳性微血管密度大约是对照组和水凝胶组的三倍（图 9b, c, f, g 和补充图 44, 45 ）。同样， P/H+Red 和 HIL@Z/P/H+Red 组的 α-SMA 的相对表达水平分别为 6.1% 和 5.7% ，明显高于对照组（ 2.7% ）、水凝胶组（ 2.6% ）、 P/H （ 4.3% ）和 P/H+GW4960 组（ 2.7% ）（图 9d, h 和补充图 46 ）。简而言之，这些免疫组化染色结果表明， HIL@Z/P/H+Red 治疗能有效缓解伤口床的局部低氧，下调 HIF-1α 表达，并上调 VEGF 、 CD31 和 α-SMA 的表达，从而有效加速伤口愈合。

肿瘤复发/转移和未愈合伤口是决定术后黑色素瘤患者总生存率和生活质量的两个不容忽视的问题。低氧是大多数实体瘤和慢性伤口的共同特征，由于严重损伤的微血管导致的氧气供应不足以及快速增殖的肿瘤细胞对氧气需求增加，低氧状况进一步恶化。这不仅通过严重限制关键的 ROS 生成促进了肿瘤对多种疗法（光动力治疗、声动力治疗、放射治疗等）的抗性，还显著激活了 HIF-1α 的表达，HIF-1α影响转移级联中的多个关键步骤，如上皮 - 间充质转化、侵袭和在远处部位建立前转移位点等。此外，恶化的低氧还被发现严重延迟了伤口愈合，通过损害血管生成、重上皮化和组织再生，这些过程都依赖于充足的氧气供应。因此，主要包括 “ 携氧 ” （血红蛋白、全氟碳等）和 “ 生成氧 ” （过氧化钙、过氧化氢酶等）策略的各种生成氧系统应运而生，以缓解低氧微环境。然而，这些供氧系统的氧气供应只能持续很短的时间，无法满足肿瘤复发 / 转移抑制和伤口愈合促进的长期需求。因此，仍然急需一个能够持续为术后伤口提供氧气的有效系统。为了解决这些问题，作者利用藻类微生物固有的持久自我供氧特性，开发了一种便携式辅助治疗系统。丰富的光合产生的氧气显示出在抑制肿瘤复发 / 转移和显著促进伤口愈合方面的卓越抑制效果。由于氧气已被发现可以使 M2 型肿瘤相关巨噬细胞重新极化为 M1 亚型，并激活 T 细胞和 NK 细胞。作者的研究还表明，缓解低氧可以有效促进巨噬细胞 / 细胞毒性 T 细胞渗入肿瘤，这可能在通过免疫治疗治愈肿瘤方面具有巨大潜力。总的来说，本工作中开发的具有持久自我供氧特性的工程治疗系统在治疗低氧相关的各种疾病（如癌症、细菌感染、难治性角膜炎、糖尿病伤口、缺血性中风等）方面显示出很大的应用潜力。

总之，作者开发了基于 HIL@Z/P/H 的治疗系统，用于预防肿瘤复发 / 转移和促进切除后的伤口愈合。在近红外激光下，针对肿瘤的 HIL@Z 纳米药物可以通过光动力治疗诱导的级联反应同时增加细胞内活性物质和降低 GSH 来破坏氧化还原平衡。由光合作用的 PCC 7942 产生的持久和可控制的 O2 供应能有效逆转肿瘤细胞和术后伤口床的低氧微环境。补充的氧气不仅有效增强了光动力治疗诱导的硝化应激触发的细胞死亡，以防止残留肿瘤细胞的局部复发，还阻断了 HIF-1α 信号通路，抑制了其远程转移。此外， HIL@Z/P/H 表现出令人满意的血管生成和促进伤口愈合行为，归功于 PCC 7942 分泌的 EVs 和光合产生的 O2 的协同效应。综合考虑，这种多功能的 HIL@Z/P/H 能够预防肿瘤复发 / 转移的同时促进伤口愈合，显示出在术后肿瘤治疗中的巨大应用潜力。

参考文献

Chen, S., Luo, Y., He, Y. et al. In-situ-sprayed therapeutic hydrogel for oxygen-actuated Janus regulation of postsurgical tumor recurrence/metastasis and wound healing.Nat. Commun.15, 814 (2024).

来源：纳在浙里