北京
人体肠道菌群在整个生命活动过程处于动态变化，但是在生命早期最关键的2～3 岁婴幼儿阶段，肠道微生物逐渐趋于成人化，之后处于相对稳定阶段。其中，随着宿主年龄的变化，双歧杆菌（
Bifidobacterium）种群结构也发生变化 。 目前报道显示，长双歧杆菌长亚种（
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longum）在治疗胃肠道相关疾病、维持肠道微生物平衡、调节宿主免疫、缓解过敏症状以及抗感染等方面展现出卓越的益生特性，在医药、食品领域作为潜在益生菌资源受到普遍关注 。
石河子大学食品学院的王明芳、陈丽澜、倪永清*等基于新疆地域宽广、各民族之间很少通婚的区域特点，针对新疆伊宁县哈萨克族学龄儿童，对其粪便中双歧杆菌进行分离鉴定，重点开展占优势的
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longum菌株的耐酸、耐胆盐能力、抑菌活性、抗生素耐药性、体外抗氧化能力、碳水化合物代谢等体外益生特征实验。从中筛选具有潜在益生特性的菌株，以期为后期体内实验开发适应特定区域人群的高活性益生双歧杆菌及产品奠定基础。
1双歧杆菌的分离与鉴定
groEL基因测序，19 份学龄儿童粪便样本中共分离得到416 株双歧杆菌，其中
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longum336 株、
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bifidum35 株、
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pseudocatenulatum14 株、
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catenulatum19 株、
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breve12 株。选取部分菌株
groEL基因序列构建系统发育树见图1。双歧杆菌分布在3 个大分支中，其中
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longum
B
bifidum
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breve位于独立的分支，
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pseudocatenulatum
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catenulatum共同组成一个分支。
2
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longum遗传差异性分析
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longum进行HMOs基因扩增，凝胶电泳结果显示均为
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longum。根据rep-PCR指纹分型技术，从带型相同的菌株中挑选2～4 个典型菌株，共得到27 株代表性菌株（表2），采用Gel Compar II软件将3 种不同引物对应的指纹图谱进行聚类。由BOXAIRPCR、m13-PCR和(GTG) 5 -PCR指纹聚类图（图2）可见，
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longum的指纹图谱带型丰富，遗传多样性较高。
3益生特性分析
3.1 酸、胆盐耐受性分析
如表3所示，厌氧培养4 h后，所有菌株在pH 4.0的MRS培养基中均能存活，且菌株2B33-3在pH 4.0的存活率达到170.83%；但菌株1B11-26、1B62-16、1B62-15和2B130-4在pH 3.5的MRS培养基中存活率低于0.0001%。总体而言，27 株
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longum代表菌株均具有较强的耐酸能力，其中菌株2B3-21、2B13-5、2B33-3和1B68-16的耐受性最强。
厌氧培养2.5 h后，实验中所有
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longum均能够在添加0.1%胆盐的MRS培养基中存活，菌株1B23-11的存活率最高，为81.81%，菌株2B13-5的存活率最低，为5.31%。当胆盐质量分数为0.2%时，菌株2B6-28的存活率低于0.0001%，菌株2B13-28的存活率最高，为64.05%。相对而言，菌株1B23-11、1B68-16、2B13-28和2B33-3的耐胆盐能力最优。
3.2抑菌活性分析
采用牛津杯法检测27 株
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longum代表菌株对常见致腹泻病原菌的抑菌活性，结果见表4。实验菌株中有22 株
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longum发酵上清液具有较好的抑菌性能，均可以抑制致泻大肠埃希氏菌CICC 10411、出血性大肠埃希氏菌CICC 21530、鼠伤寒血清型肠沙门氏菌肠亚种CICC 10420、产肠毒素大肠埃希氏菌CICC 10421、单核细胞性李斯特菌CGMCC 1.9136、血清型肠炎沙门氏菌肠亚种CGMCC 1.10754，其中菌株1B68-16、2B13-5、2B33-3和1B39-2的抑菌能力较强。
3.3 耐药性分析
根据纸片琼脂扩散法对27 株
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longum代表菌株进行16 种抗生素抗性分析，从图3可知，所有菌株对氨苄西林、利福平、米诺环素敏感，对安西林、卡那霉素、诺氟沙星、氨曲南、左氧氟沙星表现中敏或耐药。14 株对头孢噻肟敏感，20 株对青霉素敏感，21 株对四环素敏感，14 株对庆大霉素敏感，24 株对链霉素敏感，7 株对万古霉素敏感。除菌株1B62-16对阿卡米星敏感，菌株1B23-11、2B130-3和1B5-4对苯唑西林敏感，其余菌株对以上两种抗生素均表现中敏或耐药。总体而言，菌株2B13-28、2B6-28、2B102-10对大多数抗生素耐药。
3.4体外抗氧化能力分析
3.4.1ABTS阳离子自由基清除能力
由图4a可知，待测
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longum无细胞提取物组对ABTS阳离子自由基清除率最高，13 株菌株的清除率高于80%，其中菌株2B25-16清除率最高，达到89.49%；菌株2B3-21清除率最低，为24.21%。发酵上清液组的ABTS阳离子自由基清除率略低于无细胞提取物组，其中菌株2B3-21的清除率最高，为84.4%；菌株1B63-15的清除率最低，为23.29%。而菌体细胞组对ABTS阳离子自由基清除水平最低，其中菌株2B33-3的清除率最高，为74.95%；菌株1B23-1清除率最低，为39.26%。综上，待测菌株对ABTS阳离子自由基清除作用的代谢物可能主要存在于无细胞提取物中，菌株2B13-28、2B6-28、2B33-3和1B68-16对ABTS阳离子自由基总体清除效果较好。
3.4.2 DPPH自由基清除能力
由图4b可知，待测
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longum发酵上清液组对DPPH自由基清除率最高，除菌株1B63-15和2B3-6外，其余菌株的清除率均高于50%，其中菌株1B38-1清除率最高，达到91.81%。待测菌株无细胞提取物组的DPPH自由基清除率介于30%～80%之间，其中菌株2B13-28的清除率最高，为76.69%；菌株1B11-26的清除率最低，为30.79%。菌体细胞组对DPPH自由基清除水平体现了较大的菌株差异性，其中菌株1B38-1的清除率最高，为77.6%，其次是菌株1B68-16，其余菌株的清除率均低于70%。菌株1B13-11的清除率最低，为20.9%。综上，待测菌株对DPPH自由基清除作用的代谢物可能主要存在于发酵上清液中，菌株1B38-1、2B33-3、1B68-16和2B13-28对DPPH自由基总体清除效果较好。
3.4.3 碳水化合物代谢分析
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longum能利用多种宿主与饮食来源的聚糖是其在不同年龄段人群肠道内均能定植的主要因素之一。本研究选取18 种植物源聚糖对27 株
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longum进行糖发酵实验，碳源代谢结果使用TBtools软件绘制热图并聚类（图5）。受试菌株中，15 株能有效利用低聚果糖，16 株能有效利用低聚异麦芽糖，17 株能有效利用大豆低聚糖，8 株能很好地利用菊粉，10 株能有效利用苹果果胶，17 株能有效利用棉子糖，18 株有效利用麦芽糊精，17 株有效利用水苏糖，9 株有效利用聚葡萄糖，10 株有效利用壳寡糖。除菌株1B3-21外，其余菌株都不能有效利用木糖醇。相反，除菌株1B11-26外，其余26 株菌株都能很好地利用低聚半乳糖。菌株1B38-1和2B130-3能有效利用抗性淀粉，菌株1B5-4、1B39-2、1B63-15和2B102-10能有效利用低聚木糖，菌株1B38-1、2B130-3、2B130-4、1B13-11和1B3-21能有效利用
D-海藻糖，菌株2B102-3、1B23-11、1B13-11、2B6-28和2B17-16能很好地利用甘露糖醇和
L-山梨糖。
4 讨论与结论
针对新疆少数民族肠道双歧杆菌的研究前期主要集中在母婴群体的差异性方面，课题组从新疆维吾尔族婴幼儿粪便中分离得到双歧杆菌
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infantis
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suis
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bifidum
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pseudocatenulatum
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adolescentis；从另一组维吾尔族母婴肠道中分离到双歧杆菌
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longum
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pseudolongum
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breve
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animalsubsp.
lactis。根据文献报道，大部分母乳喂养、顺产的婴幼儿以婴儿型双歧杆菌为主，在成人化的学龄儿童中
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longum是最常见的种，在一部分儿童中有报道以
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breve为优势种；除此之外，学龄儿童成人型双歧杆菌的频繁分离，显示“婴儿型双歧杆菌”与“成人型双歧杆菌”只有相对丰度差异，没有明确的年龄界限，很可能双歧杆菌菌群结构的演变需要更长的时间。同时，本研究基于BOXAIR、m13和(GTG) 5 3 种rep-PCR指纹分型技术的遗传差异研究显示，所有
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longum菌株分型聚类共获得27 种基因型，显示了高度的遗传多样性。不仅揭示了不同个体肠道内
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longum菌株遗传差异，同时发现来自同一个体有多个菌株基因型现象存在，例如来自同一个体的菌株2B3-6和2B3-21，这表明人类个体在有限的时间内双歧杆菌同种肠道细菌群体遗传结构呈现进化的动态变化特征和遗传多态性，但仍需要开展更深入、全面的研究。这对于揭示以双歧杆菌为代表的益生菌理论的认识和拓展目前仅认为益生特性是菌株特异性的有限认知很有必要。
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longum在人体胃肠道定植过程中会受到酸、胆盐、各种消化酶、宿主免疫以及肠道内其他微生物和抗生素的影响。然而，
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longum通过对宿主源以及植物源多糖的竞争优势成功定植于不同年龄段人群胃肠道中，并保持极高的丰度。此研究受试菌株的耐酸耐胆盐能力较强，个别菌株在低pH值和较高胆盐质量分数的培养液中的存活率可分别达到170.83%、81.81%。此研究抑菌活性分析结果表明，所有受试菌株都对出血性大肠埃希氏菌和鼠伤寒血清型肠沙门氏菌表现出抑菌活性。有研究表明，
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longum对氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素表现出耐药。此外，此研究耐药分析结果表明受试菌株对-内酰胺类和四环素类抗生素表现敏感。体外抗氧化能力分析结果表明，菌株的无细胞提取物对ABTS阳离子自由基清除能力最强，发酵上清液对DPPH自由基清除率最高。
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longum除了可以有效利用HMOs外，还能代谢多种植物源寡糖和聚糖，例如半纤维素和果胶。此实验中除菌株1B62-15外，受试菌株都能有效利用多种植物源聚糖。
此研究对哈萨克族学龄儿童肠道双歧杆菌进行分离鉴定，通过基因型和表型相结合的方法对
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longum代表性菌株进行分析后发现，菌株1B68-16和2B33-3可作为潜在益生菌菌株进行后期体内益生特性研究。
文章引用信息
本文《 人源分离长双歧杆菌长亚种的体外益生特性分析 》来源于《食品科学》2023年45卷2期155-162页. 作 者： 王明芳 ，陈丽澜 ，张雪玲 ，田丰伟 ，倪永清 * . D O I: 10.7506/spkx1002-6630-20230408-068 . 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑：栾文莉；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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