Nat neurosci丨直接神经元重编程的表观基因组重塑机制

直接神经元重编程是一种细胞命运转换技术，它允许非神经元细胞类型，如皮肤纤维母细胞、星形胶质细胞或其他成体细胞，通过表达一组特定的转录因子直接转化为功能性的神经元细胞，而无需先回溯到多能干细胞状态。然而，实现这一过程的表观基因组重塑机制仍不清楚。

基于此，2024年7月2日德国慕尼黑大学Magdalena Götz研究团队在Nature neuroscience发表“Direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes is associated with multiscale epigenome remodeling and requires Yy1”揭示了直接神经元重编程是指将非神经元细胞类型，如小鼠的星形胶质细胞，直接转化为功能性神经元的过程，无需经过多能干细胞阶段。

Yy1是一个重要的多功能转录因子，参与调控多种生物学过程，包括细胞增殖、分化、凋亡以及干细胞的自我更新等。本研究中，研究人员结合了单细胞多组学技术与全基因组水平分析探究了由转录因子Neurogenin2（Ngn2）及PmutNgn2（"PmutNgn2"通常指的是Ngn2的一种突变形式，这种突变阻止了Ngn2在其特定的丝氨酸或苏氨酸残基上的磷酸化）介导的小鼠星形胶质细胞向神经元转化的过程。研究显示，Ngn2驱动了动态增强子-基因相互作用位点的多层次染色质重塑。PmutNgn2则导致更高的重编程效率，并增强了与神经元成熟相关的表观遗传重塑。研究人员鉴定出了一种转录协同因子Yy1，通过直接与Ngn2相互作用被招募至目标位点。当缺失Yy1时，神经元增强子的激活、相关基因的表达以及最终的重编程过程均受到损害，而这一过程并不影响Ngn2的结合。因此，该研究突显了在直接神经元重编程中，神经发生因子相互作用蛋白的关键作用。

图一 PmutNgn2能够加速小鼠星形胶质细胞到神经元的重编程过程

研究人员使用来自出生后第5-6天小鼠初级皮层的星形胶质细胞，通过四环素诱导的慢病毒转导了绿色荧光蛋白（GFP）、Ngn2-IRES-GFP或PmutNgn2-IRES-GFP。通过免疫染色分析βIII-tubulin（标记神经元）和Gfap（标记星形胶质细胞）在诱导后2天、4天和7天的情况，结果显示神经元的比例逐渐增加。到7天时，PmutNgn2相比于Ngn2诱导产生了更高比例的iNs，并且星形胶质细胞标志物Gfap的表达减少更明显。PmutNgn2诱导产生的iNs还展现了更复杂的神经突结构，并且显示出更快的成熟迹象。连续的活细胞成像实验进一步证实，PmutNgn2转导的细胞比Ngn2转导的细胞更快获得类似神经元的形态。因此，与Ngn2相比，PmutNgn2能更有效地指导神经元细胞的形成，这部分得益于其加速的转化和成熟过程。

图二 PmutNgn2调控了一个神经元成熟转录网络

为了阐明PmutNgn2相较于Ngn2在重编程能力上提升的原因，研究者利用多组学平台，在转导后2天，对未转导的星形胶质细胞、仅转导了GFP的星形胶质细胞、Ngn2转导的星形胶质细胞以及PmutNgn2转导的星形胶质细胞进行了单细胞分辨率下的转录组学剖析。Ngn2和PmutNgn2处理的细胞与未转导的对照星形胶质细胞明显不同。基于Louvain聚类算法对联合对象进行分类，得到了五个主要的细胞簇，包括不分裂的星形胶质细胞（AST）、分裂中的（有丝分裂）星形胶质细胞（AST_M）、两个神经元群体（iN_1和iN_2）以及一小群小胶质细胞。与表型分析一致，更多的PmutNgn2处理细胞位于成熟的iN_2簇中，表明PmutNgn2诱导了一个促进神经元成熟的转录程序。GO富集分析揭示了AST簇中典型的星形胶质细胞功能，如“脂肪酸代谢过程”和“脂质分解过程”，以及在iN_1和iN_2簇中“突触组装”或“神经系统发育正向调控”。Ngn2诱导的神经元中星形胶质细胞基因（如Sox9、Gfap和Aldoc）表达较高，而在PmutNgn2诱导的神经元中神经元成熟相关基因（如Reln和Brsk2）表达上调。与GO分析结果一致，神经发生转录因子（例如Bhlhe22）和Yy1在PmutNgn2表达时上调。总的来说，PmutNgn2加速了神经元的转化和成熟过程。

图三 将小鼠胶质细胞重编程为神经元的过程需要Yy1基因的参与

为了功能性地检测Yy1在神经元重编程中的作用，研究者使用Cre表达的慢病毒在源自Yy1tm2Yshi同源小鼠的原代皮质星形胶质细胞中缺失Yy1，随后表达Ngn2。为了阐明Yy1敲除星形胶质细胞中重编程受损的分子机制，研究者进行了单细胞RNA测序。不同的iN簇与神经元基因表达增加和星形胶质细胞基因表达减少相关联。簇iN_1部分下调了与原始星形胶质细胞相关的基因，并弱上调了与早期泛神经元程序相关的基因（例如，Sox4、Hes6和Sox11），而在簇iN_2中，后者明显上调。簇iN_3代表最成熟的iN簇，星形胶质细胞基因表达下降最强，神经元基因如Dcx和Rbfox3上调。大多数Yy1敲除细胞位于不稳定的iN_1和较不成熟的iN_2状态，这与神经元标记物表达降低（例如，Dcx、Sox11、Rnd2和Map2）相关联。因此，Yy1的缺失导致了神经元重编程早期的缺陷。Yy1的缺失与综合应激反应的特征相关联（包括Atf5，一种应激响应转录因子，以及线粒体伴侣蛋白，如Hspe1和Hspd1），这可能成为直接重编程的障碍。在Yy1敲除星形胶质细胞或对照簇中并未富集，表明了在没有Yy1的情况下，这些特征对于重编程条件的特异性。正常情况下，当通过直接重编程诱导星形胶质细胞转变为神经元时，细胞会经历一系列变化，导致典型神经元基因的表达。但在缺乏Yy1的情况下，这一过程无法充分完成。

总结

该研究强调了在直接重编程过程中，Yy1等协同因子与核心转录因子（如Ngn2）之间的相互作用对于成功转换细胞命运至关重要。Yy1不仅参与调控神经元特异基因的表达，还在染色质重塑、表观遗传状态的动态变化以及神经元成熟过程中扮演关键角色。这些发现对于开发神经再生疗法具有重要意义。通过优化重编程条件，提高诱导神经元的质量和数量，可以为治疗神经退行性疾病、损伤或老化引起的神经功能丧失提供新的治疗方案。未来的研究将进一步探索如何精确控制这些协同因子的活性，以实现更高效、更安全的神经元重编程，为临床应用奠定坚实的基础。

文章来源

https://doi.org/10.1038/s41593-024-01677-5

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