Current Biology丨小鼠听觉皮层对感觉信息和选择行为的跨层次表佂

大脑皮层中感觉区域的神经元活动与当前和未来的许多行为相关，尽管已有许多神经元放电表征感知决策过程的文献，却还没有研究同时记录跨皮层层次的决策相关信号。最近来自Champalimaud神经科学研究中心发表的名为Differential representation of sensory information and behavioral choice across layers of the mouse auditory cortex的研究同时记录不同层次的听觉皮层神经元，表明小鼠听觉皮层神经元会在时间和空间上区分刺激阶段和决策选择阶段，表征声音刺激的神经元先放电，表征选择的神经元紧随其后，且这两种响应模式与听觉皮层的不同深度相关。

延迟响应的声音判别行为范式

为了区分刺激响应阶段和决策阶段的神经元活动，即作者训练了一个特殊的双选项强迫选择任务（two-alternative forced-choice , 2AFC)，该范式中小鼠需要在刺激发生的一段时间后再进行对不同频率的判别。在每次试验中，两边扬声器会同时发出一段150毫秒长的音频，小鼠通过舔舐左侧或右侧的水嘴来判断音频的频率是高于还是低于设置的边界（14 kHz）以获得奖励。为了在时间上分离和声音频率的表征相关或者和舔水行为相关的神经元活动，小鼠被训练在500毫秒的延迟期间保持不响应，延迟结束时用一段50ms的激光作为视觉信号（go signal）让小鼠开始进行舔水选择行为。

由于该实验范式较为复杂，研究团队采用了循序渐进的方式进行细致训练。在训练前需要对动物进行渴水操作，并且会在鼠笼（homecage）中放入铝制管，让小鼠适应进入铝制管并在末端获得水奖励这一过程，之后实验员逐渐手持铝制管来让小鼠饮水。待小鼠习惯进入铝制管饮水并接受实验员的操作后，它们就被放置在行为训练装置中，头部固定并学会舔舐水嘴，完成后续任务。

上表展示了训练各阶段的参数，包括声音刺激的持续时间、播放的音频频率、随机自动水奖励的试验比例、错误行为后的时间惩罚和反应延迟期的时间。在训练的第一个阶段，每3.1秒随机播放一次高频率（22-40 kHz）或低频率（5-8.5 kHz）的声音，判断音频高低的阈值为14 kHz，音量60 dB，持续600毫秒，来提示哪一个水嘴有水。声音开始播放150毫秒后，一个绿色LED灯会进行50毫秒闪烁来指示时长为1.5秒的决策行为反应期的开始。为了提升小鼠参与的积极度，会随机选取10%的实验在声音开始播放150毫秒后直接提供一次水奖励。之后会逐渐将播放的声音持续时间缩短到150毫秒，反应期缩短到1秒。一旦小鼠学会在40个连续试验中至少34次选择舔舐了正确的水嘴，就将反应延迟期引入试验，并逐渐延迟视觉go信号的出现。

在正式探究神经元活动前，研究者们先将试验分为三类：有效试验（小鼠在延迟期结束后1秒的反应窗口内舔舐了水嘴）。早熟试验（小鼠在延迟期还没结束时就舔了水嘴）和失败试验（小鼠未能在反应窗口结束前舔舐水嘴）。在训练结果中，有效试验占多数，小鼠能够区分的最小可觉差（JND）为0.17个八度音，这意味着小鼠能够察觉到大约13%的频率变化，在任务中表现出相当精细的频率辨别能力。通过双侧失活实验验证了听觉皮层对于正确执行该频率辨别任务是必要的。

Result1 听觉皮层中包含刺激和选择相关的信息

研究者使用Neuronexus硅探针记录了听觉皮层不同深度的422个的单元，其中247个表现出任务相关的活性。根据在试验中的声音频率的响应和决策行为表现，神经元被分为四类：高频音调-高报告（即对高频声音刺激响应，并在行为响应期高放电）、高频音调-低报告、低频音调-高报告和低频音调-低报告。记录到的神经元对低频音调的反应稍强，神经元的总体响应在刺激开始后约25毫秒达到峰值，然后在延迟期逐渐衰减，在刺激开始后约200毫秒处放电率略有回升。

为了量化单个细胞的放电活动中蕴含的刺激和选择相关信息，研究者为每个神经元计算单次试验的放电率曲线，并使用它来评估神经元的刺激/选择的选择性（d'²）作为试验期间时间的函数，并定义一个神经元的刺激选择性为两种选择情况下条件刺激选择性的平均值。所有与任务相关的神经元的放电结果表明，刺激相关信息在刺激开始后迅速上升，然后在延迟期迅速下降；而选择相关的信息在刺激期间较低，并在延迟期有逐渐增长的趋势。

Result2不同选择性神经元在听觉皮层分层分布

在记录过程中，听觉皮层的不同深度都观察到了与任务相关的神经元放电活动。研究者发现刺激和选择相关信息分别在听觉皮层浅层和深层中占主导地位，并根据神经元的空间分布定义了两个群体，分别为“中-浅层”（MS）和“深层”（D）神经元。在四种试验类别下，D神经元的平均放电率是等同的，而之前观察到的对低频音调的整体偏好仅限于MS神经元。另一方面，刺激开始后约200毫秒的第二次放电率高峰的出现在D神经元中更为明显。这暗示了不同层次神经元也许会分别响应声音刺激和决策行为。

在声音刺激呈现期间，两个群体中响应刺激的神经元数量明显多于响应选择的神经元。在延迟期末，MS神经元中响应刺激和选择的比例相似，而D神经元中响应选择的比例明显大于刺激。通过评估神经元群体层面刺激-选择相关的信息，再次证明声音刺激播放期间两神经元群体都编码了刺激，但在延迟期末只有D群体编码了选择。通过比较两群神经元的选择可辨别性d'²发现，在延迟期末D神经元在选择可辨别性上显著优于MS神经元。总之，这些结果表明当我们的实验范式中动物的动作和提供的听觉信息在时间上分离时，听觉皮层的编码信号会在不同深度的神经元中发生转变。

Result3听觉皮层中的选择信号

为了进一步探究听觉皮层中选择信号的性质，研究者计算了当试验中的行为表现与记录到的神经元所处半球为对侧或同侧时的平均放电率，发现听觉皮层中MS神经元和D神经元的选择编码和小鼠做出左侧或右侧的舔水活动无关。之后，研究者排除了选择信号反映的是在某一特定时刻做出动作的假设。最后，他们考虑到选择信号可能反映任务结果或是特定刺激和选择的组合，如强的决策选择信号仅在某种刺激后出现。但结果表明，声音刺激的不同对小鼠决策选择的选择性影响较少。

Result4D神经元中刺激选择性和决策选择性的关系

D神经元会在声音播放期间对刺激有选择性，也会在延迟期对决策有选择性，并且这两种选择性不同时发生。然而，D神经元中携带刺激和选择相关信号的神经元群体之间的关系还不清楚。一种可能是刺激选择性和决策选择性由不重叠的群体表示，因此神经元的刺激选择性程度并不能预测其决策选择性程度。也可能这两种信息由部分重叠的群体表示，且与任务表现相关，如响应刺激较强的神经元会地对该音调下的正确决策响应更强。

通过分析D神经元在声音刺激期间的选择性、延迟期的选择性以及计算每个神经元在某一种声音刺激下（高频/低频）在延迟期末的条件选择性，发现这两个编码方向之间存在一定正相关关系。此外，对D神经元群体来说，在刺激期间，神经元群体的放电反映了声音刺激而未指示即将做出的选择；在延迟结束时，群体信号反映了即将进行的动作而未考虑导致该动作的刺激。

Result5 噪声对决策选择性的影响

D神经元群体中的选择表征可以看作是低维相关变异性的来源，如果其中并不包含关于动物选择的实际信息，则会被视为相关噪声。研究者们采用主成分分析（PCA）定量地评估选择性编码对D神经元试验间方差的贡献，发现代表选择性的轴与PC1轴的相关性显著大于PC1轴与随机方向的相关性。因此，现有的变异性很大程度上来自带有选择相关信息的反馈信号。

总之，本研究表明，在小鼠的听觉皮层中，与选择相关的神经元放电活动在频率辨别任务中展现出时间和空间层次上的差异，浅层神经元更偏好对刺激进行响应，而深层的神经元可能在将声音信息转化为动作决策中发挥关键作用。这一发现有助于理解大脑中感官信息处理和决策机制，尤其是自上而下信号传递如何影响感觉区域的活动和决策过程。

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