Cell | 稻瘟病菌侵染相关发育的磷酸化全景图

撰文 | WJY

植物与病原菌之间存在长期的共同进化关系。其中，真菌病原体为了穿透植物坚硬的外层，已经演化出专门的侵染相关结构，如附着胞、菌丝状突起和侵染垫等。病原真菌附着胞产生的高膨压具有破坏水稻叶片角质层的功能，对全球粮食种植产业构成了巨大威胁。这种特殊侵染结构的形成伴随着重大形态学和信号转导事件的重塑。已有的研究表明，稻瘟病菌中的致病性丝裂原激活激酶1（Pmk1 MAPK）是侵染相关形态发生中的一个核心调节因子。超过三十种具有不同宿主的真菌病原菌中已经鉴定出了Pmk1的同源蛋白，这表明Pmk1对这些真菌的致病力具有关键作用。然而，Pmk1直接的功能靶标及更进一步的作用机制尚未解析。

近日，来自英国塞恩斯伯里实验室的Nicholas J. Talbot与Frank L.H. Menke团队在Cell杂志发表了题为The phosphorylation landscape of infection-related development by the rice blast fungus的研究论文，报道了在稻瘟病菌附着胞发育过程中磷酸化信号级联的重大重塑，构建了不同致病机理的真菌病原的保守性磷酸化位点图谱，并提供了附着胞调节因子Vts1毒力活性的实验证据。

在该研究中，作者首先对比了在疏水表面模拟萌发的稻瘟病菌野生型Guy11与功能缺失突变体Δpmk1不同时间点的磷酸化蛋白组。结果表明Pmk1激活环上TEY基序的磷酸化激活先于侵染相关发育，并在整个附着胞形态发生过程中都保持激活。萌发后6小时，该蛋白TEY基序的磷酸化再次增加，这暗示附着胞生长极性的显著变化伴随着Pmk1的第二次激活。对蛋白组数据的聚类分析表明，在分生孢子、萌发分生孢子和初期附着胞中存在五类不同的磷酸肽集群。总之，这些结果表明，在稻瘟菌侵染相关的发育过程中，磷酸化蛋白质组正在发生依赖于Pmk1的重大变化。

已有研究鉴定出Pmk1在不同致病机制的真菌中的同源蛋白，说明Pmk1在多种真菌侵染发育中可能具有共同的作用。因此，作者又系统考察了腐生菌、共生菌、植物病原体、人类病原体、酿酒酵母和粟酒裂殖酵母等多种真菌蛋白磷酸化位点的保守性。该研究共鉴定出1198个保守的磷酸化位点（CPR），并进行了聚类分析。作者发现稻瘟病菌的磷酸化位点在多种保持类似生活方式、形成特定侵染结构的真菌中是保守的。将这些磷酸化位点映射到蛋白质上，鉴定出了与Pmk1相关MAPK上下游的蛋白、自噬相关蛋白等，而与附着胞发育相关的5个Vast1磷酸蛋白中有4个发生了显著改变，因此Vast1途径与附着胞发育显著相关。

为进一步明确Pmk1调控蛋白磷酸化影响病原致病力的作用靶点，作者用平行反应监测的方法从Guy11和Δpmk1的靶向定量磷酸蛋白质组学数据中筛选出32个假定靶点，对未鉴定的蛋白以GO注释进行了功能分配，并对这些靶点进行了酵母双杂实验的验证。结果显示32个假定靶点中有9个与Pmk1存在直接的相互作用，包括转录因子Far1、脂质代谢相关蛋白、将附着胞形态发生的细胞周期控制与cAMP信号联系起来的SOM1，以及Mst50和Mst11，磷酸酶Ptp2，以及一组以前未鉴定的蛋白质，一个可能的调节因子Vts1。

作者随后验证了Pmk1与Vts1的互作。免疫共沉淀实验显示在附着胞发育的4小时后，Pmk1与Vts1存在相互作用，且Vts1中的3个磷酸化位点只有S175和S420被Pmk1磷酸化。体外激酶和质谱实验表明，Pmk1特异性地磷酸的Vts1的S175和S420位点，即Vts1是Pmk1的直接底物。向功能缺陷株系Δvts1中转化Vts1拟磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白后的侵染植物实验表明，非磷酸化Vts1A175的菌株诱发稻瘟病的能力和侵染进展受到严重损害。这说明Pmk1磷酸化Vts1的S175位点对病原菌在植物侵染期间的毒力活性至关重要。

综上，作者结合质谱与靶向定量的磷酸化蛋白组学鉴定了稻瘟病菌附着胞发育过程中的磷酸化多肽集，分析了三种生活类型病原菌磷酸化位点的保守性，并通过体内外实验鉴定并验证了Pmk1的关键靶标Vts1及其作用机制，为控制世界性的真菌病害提供了扎实的理论基础。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.04.007