高通量基因分型技术-KASP分型

‍ 竞争性等位基因特异性PCR（kompetitive allele-specific PCR，KASP）是一种基于已知SNP的终点荧光基因分型技术，可在DNA样品中对特定位点上的SNP和InDel进行精准的双等位基因检测。

KASP反应体系中包含DNA模板、2个通用荧光探针FAM和HEX、2个通用淬灭探针、2个正向引物、1个反向引物、ROX阴性参比染料和Taq酶等。

KASP基因分型技术可以用于候选基因的精细定位，以及在育种早期世代或初选群体中快速鉴定筛选携带目标功能基因的个体，淘汰非必要株系，缩减育种群体规模，可以大幅度降低育种成本、提高育种效率。特此推介KASP标记的技术流程。

KASP技术的操作步骤如图1所示，可概括为三大步：

第一步 设计引物

引物一共是三条，两条带有荧光接头的分型上游及一条通用下游。KASP预混液中的探针一共是四条，两条荧光探针和两条淬灭探针，荧光探针与淬灭探针是互补的，且荧光探针是与特异性上游引物的接头部分序列(tag sequence)一致。

第二步 普通PCR扩增

第1轮PCR：等位基因特异引物(3'末端能配对的)就可识别特定等位基因模板，完成等位基因识别，反向通用引物也会结合并完成整个PCR过程，在此阶段，荧光标记的探针仍与其互补的淬灭探针结合，并且不会产生荧光信号。

从第2轮PCR扩增开始，产物中出现携带通用标签序列(tag sequence)的模板，这步完成把通用标签序列引入与SNP对应的PCR产物中。随后携带荧光的探针通过与通用序列互补的DNA链结合而添加到PCR产物中，因此不再与其互补的淬灭探针结合，从而产生荧光信号，经多轮PCR增强PCR产物荧光信号。

第三步 荧光检测分析

利用荧光信号检测仪或荧光定量PCR仪进行信号读取，并用软件采集信号和判别等位基因类型。

图1 KASP原理示意图(杨青青 et al. 2022)

KASP平台因其具有低成本、高通量、灵活、准确等优势，目前已经广泛应用于基因定位、遗传图谱构建、群体遗传研究等多个研究领域。

双绿源可以根据客户需要在指定染色体区段或基因位点开发KASP标记，用于各类作物的候选基因的精细定位、分子标记辅助育种、F1真杂种鉴定、种子纯度鉴定、目的基因检测、回交背景选择等。此外，双绿源可基于KASP平台检测水稻中影响主要农艺性状的重要基因的功能位点，目前已开发多个功能基因的标记，具体见下表，欢迎感兴趣的老师联系咨询。

参考文献：

1.Semagn, K., Babu, R., Hearne, S. et al. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Mol Breeding 33, 1–14 (2014)

2.杨青青,唐家琪,张昌泉,等.KASP标记技术在主要农作物中的应用及展望[J].生物技术通报,2022,38(04):58-71.