《食品科学》：扬州大学孟祥忍教授等： 芝麻蛋白Ses i 3的重组表达及致敏性鉴定

芝麻过敏是食物过敏的一种，是机体摄入芝麻或芝麻制品引起的一种异常免疫反应。目前，已经被鉴定出来的芝麻过敏原蛋白有7 种，包括2S贮藏白蛋白（Ses i 1和Ses i 2）、7S类豌豆球蛋白（Ses i 3）、油质蛋白（Ses i 4和Ses i 5）和11S球蛋白（Ses i 6和Ses i 7）。其中，Ses i 3由585 个氨基酸组成，分子质量约为45 kDa，属于Cupin超家族，具有β-折叠桶的蛋白质超二级结构，由单个肽链的3 个单体结合成三角形扁平三聚体，能够抵抗热变性和酶消化，可被75%芝麻过敏患者的血清识别，是芝麻主要的过敏原之一。从芝麻中提取高纯度天然Ses i 3会遇到不可避免的问题。通过重组技术获得的食物过敏原蛋白可以较好地规避这些问题。

因此，扬州大学旅游烹饪学院的姜松松、王涛、孟祥忍等人从芝麻中提取总RNA，用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）得到芝麻蛋白Ses i 3基因，构建pET-22b(＋)质粒表达载体，转入BL21(DE3)感受态细胞宿主表达菌中诱导表达，对芝麻过敏原Ses i 3蛋白进行重组表达和纯化，并进一步建立BALB/c过敏小鼠模型对其免疫学特性进行鉴定，以期为芝麻过敏蛋白Ses i 3的量产化提供理论依据，同时也为后续芝麻致敏机理和芝麻脱敏研究奠定基础。

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重组芝麻过敏原Ses i 3蛋白的原核表达

1.1 pET-22b(＋)-Ses i 3表达载体的构建及测序

提取芝麻总RNA，检测其RT-PCR扩增产物，如图1A所示，在1 500～2 000 bp之间有一条明亮条带，大小与已公布的Ses i 3大小基本相符。将目的条带与pET-22b(＋)酶切后连接，随后进行酶切鉴定。由图1B可知，泳道1中5 000～6 000 bp的条带为载体，1 500～2 000 bp之间条带为Ses i 3基因。测序和BLAST工具分析显示与已公布的Ses i 3基因序列相似度100%，表明Ses i 3基因已被成功克隆且已连接到pET-22b(＋)表达载体上。图1C为pET-22b(＋)-Ses i 3表达载体示意图，蛋白末端为6×His标签。

1.2 重组芝麻过敏原Ses i 3蛋白的表达及纯化

为了探究在不同诱导剂浓度和温度条件下重组表达载体目的蛋白的表达情况，分别在37 ℃和15 ℃条件下添加不同浓度的IPTG，进行重组蛋白的诱导表达，结果如图2A所示。泳道1～4表明，在相同温度下，0.2 mmol/L和1 mmol/L浓度的IPTG均可较好地诱导重组Ses i 3蛋白的表达，且表达量差异不大。鉴于IPTG具有一定的毒性，故选用0.2 mmol/L为IPTG诱导表达的浓度条件。泳道6～13表明，重组芝麻过敏原Ses i 3蛋白以包涵体形式存在，且分子质量约为66 kDa。此外，目的蛋白在37 ℃和15 ℃都是以包涵体的形式存在并且表达量差异不大，因此，选择大肠杆菌生长常规最适温度37 ℃作为诱导表达条件。包涵体蛋白溶解透析复性后，用镍离子吸附柱纯化带有His标签的重组芝麻过敏原Ses i 3蛋白。由图2B可见，经过纯化后，在66 kDa附近基本没有出现目的蛋白条带以外的其他蛋白，因此达到预期纯化的效果。包涵体蛋白通过纯化后进行复性，图2C表明，复性的芝麻过敏原Ses i 3蛋白条带单一，纯度较高，无杂蛋白，且复性后表达情况良好。Western blot结果（图2D）显示，蛋白与HRP anti-6×His tag小鼠单克隆抗体在大约66 kDa附近有明显结合，这表明重组Ses i 3蛋白具有一定的活性，可用于后续实验。

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芝麻过敏原Ses i 3蛋白的致敏性鉴定

本研究采用BALB/c小鼠模型对R-Ses i 3的致敏性进行评估。如图3A所示，与PBS组相比，N-Ses i 3和R-Ses i 3组的小鼠经大剂量刺激后，体温均极显著下降（P＜0.001），R-Ses i 3组的小鼠体温下降程度略强于N-Ses i 3，但无显著差异。小鼠过敏症状评分如图3B所示，N-Ses i 3和R-Ses i 3组绝大部分的小鼠表现出较为强烈的过敏症状，其中，1 只R-Ses i 3组的小鼠出现刺激后抽搐的症状。这表明，N-Ses i 3和R-Ses i 3都引起小鼠产生明显的食物过敏症状。

如图4所示，N-Ses i 3和R-Ses i 3组的小鼠血清中IgE和IgG含量均极显著高于PBS组（P＜0.001），表明N-Ses i 3和R-Ses i 3都具有诱发小鼠芝麻过敏的能力，且在N-Ses i 3和R-Ses i 3组的小鼠血清中IgG1滴度明显大于IgG2a的滴度，表明在两组小鼠体内过敏反应均为Th2型。此外，N-Ses i 3和R-Ses i 3组的小鼠血清中特异性抗体的滴度基本相似，但IgG2a有轻微差别。

如图5A～C所示，N-Ses i 3和R-Ses i 3组的小鼠血清中Th2型细胞因子IL-4和IL-5均显著高于PBS组（P＜0.05），而Th1型细胞因子IFN-γ与对照组相比无明显差异，这表明N-Ses i 3和R-Ses i 3都可以通过上调Th2型细胞因子诱发小鼠Th2型过敏反应。此外，N-Ses i 3和R-Ses i 3组小鼠的血浆中组胺含量（图5D）较PBS组都极显著升高（P＜0.001），这也证明N-Ses i 3和R-Ses i 3诱导小鼠脱颗粒的能力相似。

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本研究对芝麻过敏原蛋白Ses i 3进行重组表达并发现其以包涵体形式存在，随后对包涵体蛋白进行变复性处理，最终得到纯度较高的R-Ses i 3。当重组蛋白在细胞中以包涵体形式表达时，虽然纯化步骤较可溶性表达繁琐，但也存在一定的优点，包涵体中的重组蛋白表达较高，变复性后可获得高纯度的蛋白。重组表达系统主要有原核表达系统、真核表达系统和无细胞表达系统。而大肠杆菌表达系统作为目前最成熟的表达系统，具有培养条件简单、生长繁殖快、基因操作容易、价格低廉以及快速生产目的蛋白等优点，该表达系统在生产花生、鱼虾等多种致敏性较强的食物过敏原重组蛋白中取得较大的进展。 此外，本研究中 R-Ses i 3 分子质量约为 66 kDa ，而 N-Ses i 3 分子质量约为 45 kDa ，推测可能与 pET-22b( ＋ ) 载体表达的融合标签及分子间和分子内的静电斥力有关。本研究进一步采用 BALB/c 小鼠模型评估 R-Ses i 3 与 N-Ses i 3 的致敏性。小鼠过敏模型的建立是评估重组蛋白与天然蛋白致敏性差异的有效方法。史云凤则采用 Rosetta(DE3) 大肠杆菌表达系统，成功重组了花生过敏原 Ara h 1 蛋白，通过建立 BALB/c 小鼠过敏模型证明重组 Ara h 1 与天然 Ara h 1 蛋白具有相似诱发 BALB/c 小鼠过敏反应的能力。这与本研究中利用 BL21(DE3) 大肠杆菌表达系统重组表达的 R-Ses i 3 与 N-Ses i 3 可以诱发小鼠芝麻过敏反应及脱颗粒的结果一致，可用于后续免疫学相关实验。

近年来，重组表达的食物过敏原蛋白在食物过敏机制研究及低致敏性食物开发研究上具有良好的应用前景。此外，重组蛋白在定位过敏原蛋白的抗原表位上也具有较大的应用潜力。

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结论

本研究成功重组表达纯化了芝麻过敏原蛋白Ses i 3，并通过动物实验证实了其与天然Ses i 3蛋白具有相似的免疫学性质，可用于后续芝麻致敏性及致敏机制研究，为未来进一步制备低致敏性芝麻制品奠定了基础。

本文《芝麻蛋白Ses i 3的重组表达及致敏性鉴定》来源于《食品科学》2023年44卷22期126-132页，作者：姜松松，王涛，汤鑫磊，李倩，黄雨彤，虞丹丹，孟祥忍。DOI：10.7506/spkx1002-6630-20230212-109。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：东北农业大学食品学院 胡婧瑶；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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