J Virol. | 非洲猪瘟病毒pH240R通过抑制I型干扰素信号通路来增强病毒复制

大家好！今天给大家分享一篇中国农业科学院哈尔滨兽医研究所翁长江研究员团队于2024年3月在Journal of Virology上发表了一篇题为“African swine fever virus pH240R enhances viral replication via inhibition of the type I IFN signaling pathway”（非洲猪瘟病毒pH240R通过抑制I型干扰素信号通路来增强病毒复制）的文章。

研究背景

非洲猪瘟(African swine fever , ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)在家猪和野猪中引起的一种急性、出血性、高度接触性传染病。目前还没有安全有效的预防ASF的药物和疫苗，因此，研究影响ASFV毒力和复制的重要蛋白是开发有效疫苗和药物的关键。

IFN是一种重要的抗病毒细胞因子，可在病毒感染过程中诱导产生干扰素刺激基因(ISGs)，发挥间接抗病毒作用。已有研究表明，ASFV pH240R是一种衣壳蛋白，它参与ASFV的组装。与亲本ASFV HLJ/18相比，含H240R基因缺失的重组ASFV(ASFV-ΔH240R)在猪肺泡巨噬细胞(PAM)中诱导炎性细胞因子的表达水平高于亲本ASFV。作者先前的研究表明，pH240R通过靶向STING抑制cGAS-STING信号通路来抑制I型干扰素的产生。值得注意的是， ASFV ΔH240R对IFN-α的敏感性高于亲本ASFV HLJ/18，目前尚不完全清楚其作用机制。

在本研究中，作者发现ASFV pH240R通过抑制I型干扰素信号通路，抑制了IFN-α诱导的ISRE的激活和ISGs的表达。在机制上，pH240R通过与IFNAR1和IFNAR2相互作用，显著干扰了IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用。此外，与亲本ASFV HLJ/18相比，ASFV-∆H240R感染诱导了更多的ISGs。作者还证实，pH240R通过抑制IFN-JAK-STAT信号通路而促进ASFV的复制。这些研究结果显示，pH240R通过抑制I型干扰素信号通路来增强ASFV的复制，这为开发ASFV减毒活疫苗提供了线索。

研究结果

结果一：pH240R通过抑制I型干扰素信号通路增强ASFV复制

作者之前的研究表明，与其亲本ASFV HLJ/18相比，IFN-α更显著地抑制ASFV-ΔH240R的复制。为检测I型干扰素信号通路对ASFV-ΔH240R复制的影响，用抗IFNAR1或抗IFNAR2抗体阻断猪肺泡巨噬细胞（PAM），随后用IFN-α处理，再用野生型ASFV(ASFV-WT)或H240R缺陷型ASFV（ASFV-ΔH240R）感染。结果表明，IFN-α对ASFV-∆H240R的抑制作用强于其亲本ASFV HLJ/18，而阻断IFNAR1和IFNAR2则挽救了IFN-α对ASFV-HLJ/18和ASFV-ΔH240R复制的抑制作用，表明IFN-α激活的I型干扰素信号通路是抑制ASFV复制所必需的(图1A)。为了证实这一结论，猪肺泡巨噬细胞（PAMs）进行加或不加TYK2抑制剂的处理。结果表明，与其亲本ASFV HLJ/18相比，TYK2抑制剂促进了ASFV-ΔH240R在猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中的复制，并减弱了IFN-α对ASFV-ΔH240R复制的抑制作用(图1B)。

为了探讨IFANR2及I型IFN信号通路对ASFV复制的影响，用针对IFANR2基因的小干扰RNA（siRNA）感染PAM细胞，然后以相同基因组拷贝数108感染ASFV-WT或ASFV-ΔH240R 24 h。结果表明，感染ASFV-WT或ASFV-ΔH240R的PAM中，携带siIFNAR2诱导的Isg56的mRNA水平降低，ASFV-ΔH240R诱导的Isg56的mRNA转录水平比ASFV HLJ/18高(图1C)。作者还发现，下调IFNAR2的表达增加了ASFV-WT和ASFV-ΔH240R的病毒滴度，并且ASFV-ΔH240R的病毒滴度低于ASFV-WT(图1D)。综上所述，结果表明ASFV pH240R是ASFV复制所必需的，它通过抑制I型干扰素信号通路而增强ASFV复制。

图1 ASFV pH240R通过抑制I型IFN信号通路增强ASFV复制

结果二：ASFV pH240R抑制ISGs的产生

为了评估ASFV pH240R对ISGs产生的潜在作用，将剂量递增表达pH240R的质粒分别与ISRE、ISG54和ISG56中的一种报告基因，与Renilla-TK Luc共转染HEK293T细胞24 h，随后用IFN-α处理6 h，收集细胞进行荧光素酶活性检测。结果显示，pH240R以剂量依赖的方式抑制ISRE、ISG54和ISG56的启动子活性（图2A-C）。通过定量聚合酶链式反应(qPCR)检测mRNA表达水平，结果显示，pH240R以剂量依赖的方式抑制ISG15、ISG54和ISG56的mRNA表达(图2D-F)。综上所述，研究结果表明，pH240R抑制I型干扰素信号通路。

图2 ASFV编码的pH240R抑制I型干扰素信号通路

结果三：ASFV-ΔH240R比ASFV-WT诱导更多的ISG

为进一步检测H240R基因在ASFV感染时对ISGs合成的影响，用拷贝数为108的ASFV-ΔH240R或其亲本ASFV-WT感染PAM细胞12h，随后用IFN-α处理细胞12h。收集细胞，用定量聚合酶链式反应(qPCR)检测ISGs的mRNA表达水平。结果显示，与ASFV-ΔH240R相比，ASFV-WT感染显著抑制了IFN-α诱导的ISGs的基因表达水平（图3A-D）。作者注意到虽然ASFV-WT和ASFV-ΔH240R的基因组DNA拷贝数没有差异，但ASFV-ΔH240R的基因组DNA拷贝数显著低于ASFV-WT(图3E)，排除了ASFV-ΔH240R对ISGs的影响是由于更多的病毒颗粒而不是H240R基因功能丧失所致。

图3 ASFV-ΔH240R比ASFV-WT诱导更多的ISG

结果四：ASFV pH240R通过与IFNAR1和IFNAR2相互作用来干扰IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用

为了进一步阐明pH240R抑制I型IFN信号通路的靶点，作者首先检测了pH240R是否通过直接靶向ISGF3来抑制ISGs的转录。将表达pH240R和ISGF3组分的质粒分别与ISRE报告基因和Renilla-TK Luc转染HEK293T细胞。结果表明，pH240R不能抑制ISGF3介导的ISRE报告基因的激活(图4A)，揭示pH240R负调控ISGF3上游的I型干扰素信号通路。作者为进一步探索pH240R在I型干扰素信号通路中的靶分子，将表达pH240R的质粒与表达IFNAR1、IFNAR2的质粒分别转染HEK293T细胞，进行免疫共沉淀（Co-IP）检测。结果表明，pH240R与IFNAR1和IFNAR2免疫沉淀（图4B）。随后用ASFV-WT感染PAM 24 h后，用抗IFNAR1/IFNAR2抗体进行Co-IP，在感染ASFV的PAM中验证了内源性IFNAR1/2和ASFV编码的pH240R的相互作用(图4C)。此外，作者还证实了在CRL-2843细胞中，pH240R与IFNAR1和IFNAR2共定位(图4 D、E)。

图4 ASFV pH240R与IFNAR1和IFNAR2相互作用

I型干扰素与IFNAR1和IFNAR2结合，分别募集TYK2和JAK1来触发级联信号。为了检测ASFV pH240R是否干扰IFNAR1-TYK2或IFNAR2-JAK1的相互作用，将HA-IFNAR1/ HA-IFNAR2、Flag-pH240R和Flag-TYK2/ JAK1单独或共同转染HEK293T细胞进行Co-IP（图5A、B）。将FLAG-pH240R表达载体转染HEK293T细胞24 h，加入IFN-α处理细胞6 h，再用抗IFNAR1 抗体(图5C)或抗 IFNAR2 抗体(图5D)进行Co-IP。结果表示，过表达的pH240R显著降低了外源IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1之间的相互作用，以及内源IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1之间的相互作用。已有研究报道在募集TYK2和JAK1后，IFNAR1/2被磷酸化，随后TYK2和JAK1被自动磷酸化。作者还发现，当pH240R过表达时，IFNAR1、TYK2和JAK1的酪氨酸磷酸化水平显著降低。综上所述，结果表明，pH240R通过与IFNAR1和IFNAR2相互作用来抑制IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用，并降低IFNAR1、JAK1和TYK2的磷酸化水平(图5E、F)。

图5 ASFV pH240R干扰IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用

结果五：ASFV pH240R抑制STAT1和STAT2的磷酸化

STAT1和STAT2的磷酸化是I型干扰素信号通路下游的关键因子。为了确定ASFV pH240R是否抑制了IFN-α诱导的STAT1和STAT2的磷酸化，将表达pH240R的质粒转染HEK293T细胞24 h，加IFN-α处理细胞6 h，结果表明ASFV pH240R显著抑制了IFN-α诱导的STAT1和STAT2的磷酸化(图6 A、B)。为进一步检测H240R基因缺失是否影响STAT1和STAT2的磷酸化，用ASFV-WT或ASFV-∆H240R感染PAM，然后用IFN-α处理。作者发现ASFV-WT感染显著抑制了IFN-α诱导的STAT1和STAT2的磷酸化水平，而ASFV-ΔH240R感染减轻了ASFV-WT对STAT1和STAT2磷酸化的抑制(图6 C、D)。综上所述，结果表明，ASFV pH240R抑制STAT1和STAT2的磷酸化。

图6 ASFV pH240R抑制STAT1和STAT2的磷酸化

结果六：ASFV pH240R抑制ISGF3的三聚体形成

磷酸化的STAT1和STAT2形成异二聚体，其募集IRF9而形成异三聚体复合体ISGF3。作者为了探索ASFV pH240R在ISGF3复合体形成中的作用，将表达量不同的pH240R质粒转染HEK293T细胞24 h，随后加入IFN-α处理6 h。结果表明，pH240R显著抑制IRF9-STAT1和IRF9-STAT2的相互作用（图7A、B）。作者还发现，与其亲本ASFV HLJ/18相比，ASFV-ΔH240R感染PAM促进了内源IRF9-STAT1和IRF9-STAT2的相互作用(图7C、D)。综上所述，pH240R不与IRF9相互作用，但抑制了ISGF3的形成，从而中断IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用。

图7 ASFV pH240R抑制ISGF3的三聚体形成

结果七：ASFV pH240R抑制STAT1和STAT2的核内转移

作者为了确定ASFV pH240R是否能抑制IFN-α诱导的STAT1和STAT2的核内转移，将表达pH240R的质粒转染HEK293T细胞24 h，然后加入IFN-α处理6 h。结果表示，过表达pH240R抑制了STAT1和STAT2的核转位（图8A、B）。为进一步检测STAT1、STAT2和IRF9的核内转移是否受H240R基因缺失的影响，用ASFV-WT或ASFV-∆H240R感染PAM，随后加入IFN-α处理。作者发现，与其亲本ASFV HLJ/18相比，H240R基因缺失促进了STAT1、STAT2和IRF9的核内转移(图8C、D)。共聚焦结果表明，pH240R的过表达抑制了STAT1和STAT2的核内转移(图8 E-H)。综上所述，结果表明ASFV pH240R抑制了STAT1和STAT2的核内转移，从而抑制了ISGs的产生。

图8 ASFV pH240R抑制STAT1和STAT2的核

内转移

小结

本研究中，作者发现ASFV pH240R是干扰素信号通路的负调控因子，通过IFNAR1和IFNAR2相互作用来破坏IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用，进而抑制ISGs的表达，从而抑制I型干扰素信号通路以增强ASFV的复制，揭示了pH240R作为潜在药物靶点的可能性，为开发ASFV减毒活疫苗和药物提供了线索。

来源：ZhaoSunLab

编辑：吃一口小猫