《食品科学》：湘潭大学李路教授等：柑橘酸腐病菌PacC的生物信息学分析及其响应pH值的表达模式

柑橘作为我国重要的经济作物，种植面积和产量均居世界第一，其风味独特，营养丰富，深受广大消费者的喜爱。但柑橘在采后极易受到指状青霉（

Penicillium digitatum

）、意大利青霉（

P.italicum

）、酸腐病菌（

Geotrichum citri-aurantii

）等采后致病真菌的侵染。环境pH值对病原真菌的生长发育和代谢具有一定调控作用，而病原真菌对环境pH值也具有一定的适应和调节能力。其中，由转录因子PacC介导的pH值信号响应途径在微生物中广泛存在，调控多种植物病原真菌的环境适应性、次级代谢和致病性。

湘潭大学化工学院的郑杰、谭小丽、李路*等首先研究不同pH值对酸腐病菌生长的影响，在全基因组水平筛选酸腐病菌

PacC

序列的信息，对其亲缘关系、基因及其编码的蛋白质结构进行预测，随后测定其在不同pH值以及果实侵染过程中的表达模式，以期为进一步研究柑橘酸腐病菌的致病机理奠定基础。

1 柑橘酸腐病菌PacC生物信息学分析

1.1 柑橘酸腐病菌PacC候选基因的筛选结果

根据柑橘酸腐病菌全基因组基因注释信息筛选到2 个

PacC

候选基因

PacC1

PacC2

。它们与白地霉

PacC

基因同源性分别高达76.7%和74.7%，可能具备

PacC

相似功能，因此，后续对这两个基因进行生物信息学和表达模式分析。

1.2 不同物种间PacC基因编码氨基酸序列比对与保守基序分析

通过与酿酒酵母（

Saccharomyces cerevisiae

）、白色念珠菌（

Candida albicans

）、黑曲霉（

Aspergillus niger

）、指状青霉（

P.digitatum

）、尖孢镰刀菌（

Fusarium oxysporum

）等其他真菌的

PacC

基因编码氨基酸序列进行对比，发现酸腐病菌PacC与上述比对真菌的蛋白结构相似，均含有3 个保守的Cys 2 His 2 锌指蛋白结构域，属于C 2 H 2 蛋白家族（图1）。利用在线网站MEME并结合MEGA7.0和TBtools软件预测上述真菌

PacC

的保守基序，共鉴定出10 个保守基序，其中Motif1、Motif2、Motif3、Motif7、Motif9高度保守。酸腐病菌

PacC1

PacC2

结构相似，具有相同的保守基序（Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif5、Motif6、Motif7、Motif9）（图2）。

1.3不同物种间的PacC系统进化分析

由系统发育树可以看出，酸腐病菌的

PacC1

PacC2

亲缘关系最近。测试物种中，与指状青霉（

P.digitatum

）、产黄青霉（

P.chrysogenum

）以及黑曲霉（

A.niger

）的亲缘关系较近，与酿酒酵母（

S.cerevisiae

）、白色念珠菌（

C.albicans

）等物种的亲缘关系较远（图3）。

1.4 柑橘酸腐病菌PacC结构特征及染色体分布

利用在线网站GSDS 2.0与MG2C v2.1对

PacC1

PacC2

的结构与染色体分布进行分析。由图4可知，

PacC1

PacC2

均只有外显子结构，外显子长度分别为1 872 bp和1 779 bp，均无内含子与UTR区域。根据图5可知，

PacC1

PacC2

分别位于第3号染色体和第10号染色体上，第3号染色体长度为2 879 209 bp，

PacC1

位于1 832 639～1 834 510 bp之间。第10号染色体长度为1 531 806 bp，

PacC2

位于877 315～879 093 bp之间。

1.5 酸腐病菌PacC蛋白结构与理化性质分析

由图6可知，PacC1与PacC2的蛋白结构具有一定差异。对其理化性质进行分析，发现PacC1与PacC2均为亲水性的不稳定蛋白，没有跨膜位点与信号肽，WoLF PSORT亚细胞定位显示二者均在细胞核内发挥功能调控作用。它们在分子质量、等电点、磷酸化位点等方面存在一定差异。其中，PacC1蛋白对应碱基数为1 872 bp，编码623 个氨基酸，PacC1分子质量为67.80 kDa，等电点为6.71，可能发生磷酸化的位点有Ser56、Thr18、Tyr8；PacC2蛋白对应含1 779 个碱基，编码592 个氨基酸，PacC2分子质量为64.32 kDa，等电点为8.50，Ser72、Thr18、Tyr13位点可能发生磷酸化（表2）。PacC1和PacC2蛋白高级结构预测见图6。

2 不同pH值对酸腐病菌菌丝生长量和PacC表达量的 影响

2.1 不同pH值对酸腐病菌菌丝生长量的影响

如图7所示，酸腐病菌在pH 2.0～11.0范围内均能生长，其中pH 3.0菌丝生长量显著高于其他pH值，其次是pH 4.0。在pH 2.5和pH 5.0～10.0范围内菌丝生长量没有显著差异。pH 2.2和11.0菌丝生长受到显著抑制，在pH＜2.2时几乎不生长。由此可知，pH值对酸腐病菌的生长具有调控作用，酸腐病菌具有广泛的pH值适应性，但其最适生长pH值约为3.0，这与许多柑橘品种果实pH值接近 。

2.2 离体条件下不同pH值对PacC表达量的影响

以酸腐病菌最适生长pH值（pH 3.0）为对照，比较

PacC1

PacC2

在不同pH值的表达情况。结果表明，

PacC1

PacC2

的表达均受pH值调控，且两个基因的表达变化趋势具有一定相似性。处理1 h时，

PacC1

PacC2

表达均在pH 11.0显著上调（

P

＜0.05），相对表达量分别约为对照的2.24 倍和1.62 倍；

PacC1

表达量在其他pH值条件下没有显著差异，但

PacC2

在pH 1.0时几乎不表达（图8）。处理24 h时，

PacC1

PacC2

表达量在pH 9.0和pH 11.0均显著上调，其中pH 9.0处理中的两个基因表达量均约为对照的4.8 倍，

PacC1

在pH 11.0的表达量约为对照的8.5 倍，而

PacC2

的上调倍数更高，约为对照的13 倍，两个基因在其他pH值的表达水平相似，但pH 1.0时

PacC2

的表达量显著上调。

3 PacC在酸腐病菌侵染柑橘果实侵染过程中的表达情况

宫川蜜橘果实人工接种酸腐病菌2 d时，果实伤口处可见明显软腐症状，病斑直径为（1.97±0.13）cm，4 d出现白色霉层，病斑直径达到（3.88±0.06）cm，至发病6 d时，果实几乎完全腐烂（图9A、B）。果实发病过程中腐烂部位的pH值呈下降趋势，在6 d时下降约0.2，显著低于对照（图9C）。酸腐病菌两个

PacC

的表达总体呈上调趋势，但

PacC1

对pH值变化的响应更快，侵染4 d时表达量即显著高于2 d，侵染6 d时表达量上调至2 d的3.9 倍，而

PacC2

的表达量在6 d才有显著上调（图9C）。尤力克柠檬果实人工接种酸腐病菌2 d时，果实伤口处也可见明显软腐症状，病斑直径为（1.92±0.14）cm，4 d时软腐面积加大，病斑直径为（3.80±0.05）cm，至发病6 d时果实几乎被白色霉层覆盖，完全腐烂（图10A、B），发病过程中腐烂部位的pH值呈上升趋势，至接种6 d时上升约0.4，显著高于对照（图10C）。酸腐病菌两个

PacC

的表达量均在侵染6 d时发生显著上调（图10C）。

采后病原真菌的侵染能力受寄主伤口、温度、湿度和环境pH值等因素的影响，其中环境pH值对病原真菌的生长和致病力有重要调控作用。许多病原真菌通过调整对微量元素的利用和体内一些蛋白质的功能应对环境pH值的变化，因此具有广泛pH值适应性。目前，丝状真菌中报道较多的pH值响应机制为pal途径，该途径包含7 个基因：

pacC

pacl

palA

palB

palC

palF

palH

palI

，其中，

PacC

作为重要的环境pH值调节因子，在微生物调节、适应环境的过程中发挥重要作用。

PacC

的结构高度保守，PacC蛋白属于C 2H 2蛋白家族，含有3 个保守的Cys 2His 2锌指蛋白结构域。采后致病真菌中，意大利青霉和指状青霉

PacC

均具有此结构。此实验对酸腐病菌候选

PacC

的氨基酸序列和保守基序进行分析，发现2 个候选基因均具有

PacC

的保守结构，且系统发育树也表明其亲缘关系与柑橘采后致病菌指状青霉较近，说明其可能与指状青霉

PacC

具有类似功能。指状青霉同样是嗜酸真菌，在侵染柑橘果实过程中

PacC

表达水平呈显著上调，且可能参与酸分泌过程改变环境pH值，

PacC

功能的缺失可导致病菌致病性显著下降。此外，指状青霉

PacC

在离体碱性条件下有高水平表达，对指状青霉的环境适应性有重要意义。因此，推测酸腐病菌

PacC

在柑橘果实致病性和病原菌环境适应性中可能具有重要调控作用。进一步对酸腐病菌两个

PacC

的结构和性质进行分析，发现

PacC1

PacC2

位于不同染色体（图5），在等电点和磷酸化位点等方面有较大差异（表2），推测这两个基因在功能上也存在一定差异。

不同的寄主组织存在显著性的pH值差异，不同病原菌生长的适宜pH值及耐受范围也存在较大差异。本实验中，离体条件下，柑橘酸腐病菌具有较广的pH值适应能力，但pH 3.0～4.0范围的生长量显著高于其他pH值（图7），而其寄主pH值范围大多约为2.0～6.0，其中柠檬类果实pH值约为2.2，宽皮柑橘类果实pH值约为3.0，甜橙类果实pH值约为5.0。因此，推测酸腐病菌在宽皮柑橘类果实中具有更强的生长能力，而实际上，酸腐病菌对pH值极低的柠檬果实也有较强侵染力，这可能与其pH值调节能力有关。

大量研究表明，中性到碱性条件下，

PacC

在细胞核中调节基因的表达，这些基因参与病原真菌的细胞壁合成、跨膜运输、细胞稳态、真菌毒力、菌丝生长、离子胁迫等方面。如指状青霉

PacC

在碱性条件下处理48 h时的表达量即上升为对照的8.4 倍；指状青霉

PacC

缺失突变体在碱性环境中无法生长，对果胶的利用能力和柑橘的致病性也大幅下降。但是

PacC

在酸性条件下的表达模式不尽相同。此实验中，离体条件下培养的酸腐病菌从最适生长pH 3.0培养基转移到不同pH值培养基中继续培养1 h时，

PacC1

PacC2

均能对环境pH值进行迅速响应，在显著抑制菌丝生长的pH 11.0处理中表达迅速上调（图8），培养24 h时，两个

PacC

的表达量在pH 9.0和pH 11.0的处理中均显著上调，且pH 11.0处理中表达量更高（图8），说明碱性环境能诱导酸腐病菌

PacC

的高水平表达，这与上述采后致病菌

PacC

的表达情况一致。值得注意的是，

PacC1

PacC2

在某些酸性条件下的表达趋势有显著差异，如pH 1.0处理1 h，

PacC2

的表达被显著抑制，同样，

PacC2

的表达水平在pH 3.0处理24 h也显著下降，而

PacC1

的表达未发生显著变化（图8），说明酸腐病菌

PacC

的表达也受酸性环境调控，可能在侵染柑橘果实过程中也有类似情况，而这两个基因呈现出不同的响应模式可能与其结构和性质的差异相关。

在侵染初期，采后病原真菌通常分泌酸或碱以调节侵染位点pH值以加速侵染进程，这一过程可能与

PacC

的调控有关。如炭黑曲霉（

A.carbonarius

PacC

缺失株侵染葡萄时不再分泌葡萄糖酸和柠檬酸；核盘病菌（

Sclerotinia sclerotiorum

PacC

直接调控草酸的分泌降低侵染位点pH值。胶胞炭疽菌（

C.gloeosporioides

）可在鳄梨组织中分泌氨，进而导致侵染位点pH值升高。此实验中，人工接种酸腐病菌的宫川蜜橘和尤力克柠檬果实侵染位点pH值的变化呈相反趋势。宫川蜜橘果实初始pH值约为3.30，随着病斑面积的扩大，发病部位的pH值逐渐下降至3.11，说明酸腐病菌与宫川蜜橘果实互作过程中的产物可导致果实腐烂部位pH值的下降，有利于病原菌的扩繁。接种后4～6 d果实病斑面积急剧增大，同时酸腐病菌

PacC

的表达量也上调，说明酸腐病菌

PacC

很可能参与对环境pH值的调控，从而促进侵染进程。

PacC

在酸腐病菌侵染尤力克柠檬果实过程中也发挥类似作用，但侵染位点pH值呈上升趋势。虽然不同品种果实发病部位pH值的变化趋势不同，但发病后期的组织pH值均更接近酸腐病菌生长的最适pH值。

结 论

环境pH值对柑橘酸腐病菌的生长具有调控作用，同时，酸腐病菌也可以一定程度的调节环境pH值。酸腐病菌的2 个

PacC

均能在碱性条件下被诱导表达，但由于基因结构和理化性质的差异，它们对pH值的响应程度和方式也有一定差别。两个

PacC

对于酸腐病菌广泛的pH值适应性以及柑橘果实侵染进程具有重要作用。

本文《柑橘酸腐病菌PacC的生物信息学分析及其响应pH值的表达模式》来源于《食品科学》2023年44卷第22期108-115页，作者：郑杰，谭小丽，胡近近，陶能国，欧阳秋丽，李茂慧，李路*。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20221209-101. 点击下方 阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑；北京林业大学生物科学与技术学院栾文莉；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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