南京师范大学团队提出黑曲霉生产L-苹果酸新策略

L-苹果酸是一种重要的有机酸，存在于多种天然果实中，具有独特的酸味和风味，且有一定的抗菌性能，在食品、医药和化工等行业中有广泛的应用，例如可以用作食品中的风味增强剂和防腐剂，因此，提高 L-苹果酸的产量具有重要的经济价值。

苹果酸是一种具有手性结构的四碳（C4）二羧酸，存在三种形式：D-苹果酸、L-苹果酸和 DL-苹果酸。自然存在的苹果酸完全以L-对映体形式存在，D-苹果酸在自然界中不常见，并且人体难以吸收。

工业生产苹果酸主要依赖于化学合成和酶方法，化学方法使用石油基原料，对环境污染较大，亟须向环保生物合成转变，而大规模微生物发酵的发展仍处于初级阶段，且在合成过程中产生多种副产物，分离难度大，操作成本高。

目前，在工业上合成 L-苹果酸方面，酵母和丝状真菌等微生物最具前景。这些潜在的工业菌株在实验室中经过基因修饰，可以强化其还原型三羧酸循环途径（rTCA），从而提高合成 L-苹果酸的能力。每种经过改造的菌株都有独特的优势，但也存在阻碍其工业应用的限制，例如产率低，副产物浓度高、分离难度大，发酵时间长等问题。

近日，来自南京师范大学的研究团队提出了一种基于微生物生产 L-苹果酸的新方法。他们利用高产 L-苹果酸的黑曲霉菌株，将大肠杆菌中的 SthA 引入黑曲霉中，并证明了 SthA 的异源表达可以增加细胞内 NADH 含量和苹果酸脱氢酶（Mdh）活性，从而促进 L-苹果酸的积累。在此基础上，通过 RNA-seq 筛选，鉴定出一个能够自然响应发酵条件的黑曲霉内源启动子（PmfsA）。使用此启动子表达 SthA 可以减轻由组成型 SthA 表达引起的黑曲霉生长和无性繁殖缺陷，同时保持优异的发酵性能。

论文中指出，经工程化改造的菌株表现出与其亲本菌株相似的表型，同时在 5 L 发酵罐中表现出优异的特性，其生产率提高了 65.5%，发酵周期缩短了 1.5 天，副产物琥珀酸降低了 76.2%。

（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）

该研究已发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry上。该论文的三位通讯作者来自南京师范大学食品与制药工程学院，其中薛锋副教授主要从事生物催化与转化、酶蛋白质工程技术研究，徐晴副教授从事微生物代谢工程研究，张弛讲师从事曲霉高效基因编辑技术的开发，高产有机酸底盘细胞的构建以及曲霉有机酸合成代谢通路的调控机制解析工作。

在这项研究中，研究团队首先分析了黑曲霉生产 L-苹果酸的 rTCA 途径。他们发现，NADH 依赖的苹果酸脱氢酶（Mdh）在这一过程中起着关键作用，发酵初期阶段 Mdh 活性不足是快速高效合成 L-苹果酸的主要瓶颈。Mdh 的活性受到多种因素的影响，其中还原当量的供应就是一个重要的限制因素，因此希望增强 NADH 的供应以增强 Mdh 的酶活性。

▲图 | 黑曲霉中用于 L-苹果酸生物合成的还原型三羧酸循环（rTCA）途径的示意图（来源：上述论文）

由于大肠杆菌中 SthA 基因负责编码的可溶性吡啶核苷酸转氢酶（STH）能够在 NADH 和 NADP(H)之间进行有效的还原当量转移。研究团队推测，如果能够将 SthA 引入到黑曲霉中，就有可能提高 Mdh 的活性，从而增加 L-苹果酸的产量。

基于此，研究团队首先构建了一个表达 SthA 基因的黑曲霉菌株，他们利用启动子 Ptef，使得 SthA 基因能够在黑曲霉的整个生命周期中持续表达。通过这种改造，成功提高了 L-苹果酸的合成效率，同时显著降低了副产物琥珀酸的生产水平。然而，这种改造引起了严重的产孢缺陷，孢子产量下降 92.12%，这将导致种子期培养前的工作量增加。

为解决这一问题，研究团队首先通过引入强力霉素（Dox）诱导型启动子，精确调节 SthA 的表达，验证了仅在发酵阶段选择性诱导 SthA 表达即可避免产包缺陷同时保持 L-苹果酸合成率的推测，但这引发了对抗生素过度使用的担忧。

为响应绿色生物合成的理念，研究团队进一步采用 RNA-seq 技术，发现了 PmfsA 启动子具有条件性表达的特点，它可以在特定的代谢阶段启动基因表达以实现精确调控。利用该启动子，研究团队实现了 SthA 基因仅在发酵阶段表达，从而避免了黑曲霉孢子形成缺陷。这种条件性表达菌株在保持与亲本菌株相似表型的同时，展现出了卓越的发酵性能。

最后，为验证在发酵系统扩大后对上述方案生产 L-苹果酸的影响，研究团队将 250 ml 的摇瓶替换为 5 L 发酵罐。与未改造的菌株相比，改造后的黑曲霉的 L-苹果酸生产力提高了 65.5%，这意味着在相同的时间内可以生产出更多的 L-苹果酸。此外，发酵周期也缩短了 1.5 天，这不仅提高了生产效率，还降低了生产成本。更为重要的是，副产物琥珀酸的积累降低了 76.2%。琥珀酸作为一种与 L-苹果酸竞争同一代谢途径的产物，其积累的减少直接导致了 L-苹果酸产量的增加。这一成果不仅证明了通过自然激活 SthA 基因表达可以有效提高黑曲霉中 L-苹果酸的产量，而且为工业规模的 L-苹果酸生物发酵提供了新的可能。

▲图 | A 为替换发酵系统示意图，BCD 分别比较了黑曲霉改造前后发酵时间、L-苹果酸产量、副产物琥珀酸产量（来源：上述论文）

综上所述，这项工作标志着通过生物发酵技术在 L-苹果酸合成方面取得的进展，展示了合成生物学在黑曲霉中的广阔应用前景。

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