中国农大团队提出高效从头合成HMO新策略，无副产物3-FL产生

二岩藻糖基乳糖（Difucosyllactose，DFL）是母乳低聚糖（HMO）的重要组成部分，属于最简单的 HMO。其中间体 2′-FL 是 HMO中含量最高的寡糖，约占人乳寡糖总量的 30%。

研究已证实，DFL 是一种典型的岩藻糖基化 HMO，不仅能促进新生儿的生长发育，还具有重要的抗菌活性。鉴于这些功能性特点，2′-FL 以及 DFL 等已被美国 FDA 和欧洲食品安全局等认证并批准为新型食品添加剂或成分。

因此，如何更高效和安全生产 DFL 成为了当下的研究热点。与其他方法相比，利用微生物细胞工厂合成 DFL 具有成本低、安全、快捷和环保等特点，有潜力成为大规模生产 DFL 的可行方法。然而，目前国内已建成用于生产 DFL 的微生物细胞工厂仍存在产量低、成本高的问题。

基于此，来自中国农业大学的研究团队提出了一种更经济有效生产岩藻糖基化 HMO 的策略。在这项研究中，该团队通过多步优化策略（multistep optimization strategies）在工程化大肠杆菌中构建了高效从头合成 DFL 的途径，在 5 L 发酵罐中工程化菌株生产了 33.45 g/L 的 DFL。据悉，这是迄今为止公开报道的最高滴度。

（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）

本文的通讯作者是中国农业大学食品科学与营养工程学院教授江正强，他的研究方向是食品生物技术，包括酶与发酵工程、新酶的结构解析及分子改造、食品营养与功能研究以及食品科学与加工。

2′-FL 是 DFL 合成的前体，不仅可以通过补救途径（salvage pathway）合成 DFL，也可以通过从头合成途径生产 DFL。此前合成 DFL 的方法主要是通过补救途径生成，这种方法在微生物细胞工厂中获得的最高滴度仅为 5.1 g/L，且底物岩藻糖成本昂贵，大规模生产不够经济；另一种方案是从头合成途径，该起源于中心碳代谢，以甘油作为碳源，乳糖作为糖基受体，通过 6 种酶催化将甘露糖-6-磷酸（mannose-6-phosphate）转化为 2'-FL。相比补救途径，从头合成 DFL 途径更具经济性和可持续性，不过目前还没有通过从头合成途径生成 DFL 的报道。

虽然还没有 DFL 的此类报道，但是领域内已经尝试通过设计从头合成途径生产 2' -FL，最大滴度达到了 120 g/L 以上。在上述工程菌株基础上，通过采取表达合适的 α-1,3-岩藻糖基转移酶和其他代谢工程方法可能是一种高效从头合成 DFL 的可行办法。

在这项研究中，该团队通过多步优化策略在工程化菌株大肠杆菌菌株中构建了高效从头合成 DFL 的途径，首次在工程化菌株中通过从头合成途径高效合成了中间体 2′-FL，然后将截短的 α-1,3/4-岩藻糖基转移酶（Hp3/4FT）引入工程菌株中从头合成了 DFL，并通过基因删除和过表达等手段增加 DFL 的产量，最终在摇瓶和发酵罐中进行发酵试验。

（来源：上述论文）

首先，为了在大肠杆菌中通过从头合成途径生成 2'-FL，该团队删除 β-半乳糖苷酶基因lacZ 生成菌株 BZ，并将质粒 pET-BCGIC 导入菌株 BZ 中构建菌株 BSF01，然后删除 wcaJ 基因构建菌株 BSF02。通过一系列试验发现缺失 lacZ 和 wcaJ 基因是合成 2′-FL 的第一步，删除这两个基因后合成 2'-FL 的产量达到 2.74 g/L，高于此前的合成量；进一步结果表示，质粒组合的优化是调节工程菌株代谢流量的有效工具，最佳质粒组合 BSF05 的合成效率显著提高了55%。

由于蛋白标签是提高靶蛋白表达和溶解度的重要工具，研究团队测试了 6 个常用蛋白质标签对于 2'-FL 合成的影响。试验结果显示，TrxA 标签对 2’-FL 的合成效果最好，是未添加标签蛋白合成 2’-FL 产量的 1.24 倍。

辅因子供给是提高目标产品滴度的关键之一。接下来，该团队测试了过表达 gsk、gmk、ndk 和 zwf 等基因增加辅因子供给对 2'-FL 合成的影响。在研究中，过表达 Ndk 和 Zwf（菌株 BSF17）合成的 2′-FL 浓度最高，达到了 7.23 g/L，比亲本菌株高了 36.7%。这表明，加强辅因子 GTP 和 NADPH 供给能促进 2'-FL 的合成。

后续，该团队开始在工程化菌株中设计从头合成途径合成 DFL，他们将幽门螺杆菌的 α-1,3/4-岩藻糖基转移酶（Hp3/4FT）引入菌株 BSF17 从而构建菌株 BSF19。在试验中，Hp3/4FT 对 2'-focusyl-LacNAc 具有高活性，这提示 2'-FL 可能是 Hp3/4FT 的合适受体。值得一提的是，菌株 BSF19 可将 2'-FL 大量转化为 DFL，这一过程中未检测到 3-FL。

▲图 | 在大肠杆菌中从头合成 DFL（来源：上述论文）

该团队还通过提高 GDP-L-岩藻糖积累和在工程菌株中引入调控因子 RcsA 提高 DFL 的产量。GDP-L- 岩藻糖是合成 DFL 的关键前体之一。研究团队发现增加 GDP-L-岩藻糖的积累有利于提高 DFL 的产量。当删除 ATP 依赖性蛋白酶（Lon）和 GDP-甘露糖水解酶（NudK），并过表达 6-磷酸甘露糖异构酶（ManA）时可以增加菌株中 GDP- L-岩藻糖的积累。相应地，对应菌株 BSF23 合成 DFL 的滴度提高了 12%。

然后，研究团队在菌株 BSF23 中单独或联合过表达调控因子 RcsA 和 RcsB，得到菌株 BSF24−BSF26。结果显示，过表达 Rcs 调节因子会影响 DFL 的浓度和工程菌株的生长，过表达 RcsA 菌株 BSF24 合成 DFL 的产量提高了 8.89%。这表明，过表达 RcsA 基因可以有效调节合成途径的基因表达水平，增加 DFL 的产量。

最后，研究人员对工程化菌株 BSF24 进行补料分批发酵实验，该菌株在摇瓶中合成 DFL 的滴度为 6.19 g/L，在 5 L 发酵罐中 78 h时合成了 33.45 g/L 的 DFL，残留 2′-FL 的浓度为 22.35 g/L，无副产物 3-FL。根据论文中的描述，这是迄今为止报道的最高滴度，此前只有两项研究使用代谢工程菌株合成 DFL，摇瓶中的最高滴度为 5.1 g/L。

▲图 | 菌株 BSF24 在 5L 发酵罐中分批补料发酵生产 DFL（来源：上述论文）

“我们的研究证实了有效合成中间体 2′-FL、适当表达 α-1,3-岩藻糖基转移酶、提高 GDP-L-岩藻糖积累以及过表达调控因子 RcsA 在生物合成 DFL 中的作用。整体来看，这项研究提供了一种更经济、可持续和高效生产 HMO 的策略。”

不过，由于试验中仍然存在中间体 2′-FL 的残留，该研究团队下一步的工作将集中在对 Hp3/4FT 进行分子修饰，以提高中间体 2'-FL 的转化效率，从而进一步提高生物合成 DFL 的经济竞争力和可行性。

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