BP-IF7.5-大连医大：芒柄花素通过改善线粒体功能障碍缓解心脏纤维化

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导读

芒柄花素是一种异黄酮化合物，由于其多种生物活性，包括对心血管系统的强大保护作用，已被广泛研究。然而，目前尚未研究芒柄花素对心脏纤维化的影响。本研究采用C57BL/6小鼠皮下注射异丙肾上腺素（ISO）建立心脏纤维化动物模型，并口服芒柄花素。结果表明，芒柄花素可逆转ISO诱发的早期心房波比值（E/A比值）所显示的心脏强直。Masson染色、免疫印迹、免疫组织化学和实时PCR显示，芒柄花素可显著抑制ISO诱导的心脏纤维化和纤维化相关蛋白（collage III、纤连蛋白、TGF-β1、α-SMA和波形蛋白）和基因（Col1a1、Col3a1、Acta2和Tgfb1）。此外，通过结合代谢组学和网络药理学，我们发现与线粒体功能相关的三个重要靶点（ALDH2、HADH和MAOB）参与了芒柄花素的有益作用。进一步的验证表明，这三个基因在心肌细胞中比在心脏成纤维细胞中具有更高的丰度。ISO处理后，心肌细胞中ALDH2和HADH的mRNA表达降低，而MOAB增加，并且这些现象被芒柄花素逆转。此外，我们还研究了心肌细胞中线粒体膜电位和ROS的产生，结果表明，芒柄花素有效改善了ISO诱导的线粒体功能障碍。总之，我们证明了芒柄花素通过调节心肌细胞中ALDH2、HADH和MAOB的表达来改善线粒体功能障碍并减轻β-肾上腺素能激活的心脏纤维化。

研究热点：

1. 芒柄花素改善ISO诱导的心脏纤维化；

2. 结合代谢组学和网络药理学发现了新的机制；

3. 芒柄花素调节心肌细胞中ALDH2、HADH和MAOB的表达；

4. 芒柄花素调节线粒体功能。

论文ID

原名：Formononetin ameliorates isoproterenol induced cardiac fibrosis through improving mitochondrial dysfunction

译名：芒柄花素通过改善线粒体功能障碍改善异丙肾上腺素诱导的心脏纤维化

期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy

IF：7.5

发表时间：2023.12

通讯作者：马郁 芳 ，Weijing Yun

通讯作者单位：大连医科大学

实验设计

实验结果

1. 芒柄花素减轻ISO诱导的心功能障碍

心室舒张功能下降是心脏纤维化的病理特征。E/A比率反映了左心室的舒张功能，这是通过脉搏波和组织多普勒成像确定的。皮下注射ISO 7天导致小鼠心肌收缩力增强（图S1），这是在C57BL/6小鼠中诱导心脏纤维化模型的常见方法。超声心动图可以通过测量E/A的比率来检测建模的成功。如图1B，C所示，ISO处理后小鼠的E/A比率显著增加。然而，模型给药低剂量芒柄花素（ISO+FL）和模型给药高剂量芒柄花素（ISO+FH）组的E/A比率低于ISO模型组（图1B，C），表明芒柄花素改善了ISO诱导的舒张功能障碍。此外，模型组的心脏重量/体重（HW/BW）和心脏重量/胫骨长度（HW/TL）增加，而芒柄花素逆转了这些现象（图1D，E）。此外，麦胚凝集素（WGA）的结果表明，芒柄花素可以抑制ISO诱导的小鼠心肌细胞肥大（图S2）。

图1 芒柄花素对心脏纤维化的影响。（A）动物实验的示意图；（B）左心室二尖瓣口充盈速度的代表性采集，显示早期（E）和晚期（A）波；（C）E/A值；（D）计算心脏重量与体重的比值；（E）计算心脏重量与胫骨长度的比值。所示数据为平均值±SEM；n=5，与对照组相比*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与模型相比，#p<0.05，###p<0.01，###p＜0.001。

2. 芒柄花素减轻ISO诱导的心肌纤维化

我们采用Masson染色法研究芒柄花素对心脏纤维化的影响。结果显示，在用芒柄花素处理后，ISO诱导的心脏纤维化显著逆转（图2A，B）。我们用蛋白质印迹法测定纤维化相关蛋白纤连蛋白、TGF-β1、α-SMA和波形蛋白。这些蛋白质的表达在ISO组中显著增加，表明这些小鼠中发生了纤维化。然而，用高剂量的芒柄花素预处理逆转了这一现象（图2C，D）。IHC染色的结果显示，在用芒柄花素处理后，胶原III的表达也受到抑制，在更高剂量下出现更大的抑制作用（图2E，F）。此外，我们使用实时PCR测量小鼠心脏中的纤维化相关基因（Col1a1、Col3a1、Acta2和Tgfb1）。在ISO处理后，Col1a1、Col3a1、Acta2和Tgfb1的表达显著增加，但芒柄花素降低了这些基因的表达（图2G-J）。总之，这些数据表明，芒柄花素改善了ISO诱导的心脏纤维化。

图2 芒柄花素改善ISO诱导的心脏纤维化。（A）Masson染色的代表性显微照片（bar=200µm）；（B）纤维化面积的定量分析；（C）心脏纤连蛋白、TGF-β1、а-SMA和波形蛋白的蛋白质印迹分析；（D）纤连蛋白、TGF-β1、а-SMA和波形蛋白在心脏中表达的定量分析。（E）免疫组织化学的代表性图像（bar=50µm）；（F）心脏纤维化面积的定量分析；（G）心脏纤维化基因的实时PCR分析。所示数据为平均值±SEM；n=5，与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01***p<0.001；与模型相比，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001。

3. 代谢物多变量分析及代谢途径分析

我们使用LC-MS/MS检测血清中的代谢产物，以寻找芒柄花素改善心脏纤维化的潜在生物标志物。我们使用无监督主成分分析来比较不同组之间的代谢组学特征。如图S3所示，QC样品被聚集在一起并分为四组，表明实验条件处于稳定状态。PLS-DA方法是一种“监督”模型，可以最大限度地减少每组之间的差异，也用于分析数据。结果显示，四组之间有显著的分离，表明芒柄花素处理对代谢有明显影响（图3A）。OPLS-DA用于搜索两组之间的差异生物标志物（图3B-D）。我们从OPLS-DA中筛选出变量投影重要性（VIP）>1的代谢产物。此外，OPLS-DA模型参数如表S4所示。根据VIP值（表S5），我们从对照组和ISO组中选择21个潜在生物标志物，从ISO组和ISO+FH组中选择24个潜在生物标记物（表S6）。有14种代谢物在两组生物标志物中重叠。热图分析用于可视化这14种生物标志物，从深红色到海军蓝的颜色变化表明代谢物的相对水平从高到低（图3E）。我们使用MetaboAnalyst 5.0对这14种生物标志物进行通路分析（图3F）；收集与这些途径相关的基因，包括精氨酸生物合成、组氨酸代谢、氨酰tRNA生物合成、丁酸代谢、β-丙氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氮代谢以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，以进行进一步分析。

图3 多变量分析的血清代谢谱。（A）PLS-DA数据中对照组、ISO组、ISO+FL组和ISO+FH组的得分散点图；（B）对照组和ISO组之间成对比较的OPLS-DA得分散点图；（C）ISO和ISO+FL组之间成对比较的OPLS-DA得分散点图；（D）ISO和ISO+FH组之间成对比较的OPLS-DA得分散点图；（E）14种代谢产物的聚类热图；（F）代谢途径涉及14种代谢产物。

4. 潜在靶点的筛选和验证

为了阐明芒柄花素在减轻ISO诱导的心脏纤维化中的潜在机制，我们收集了芒柄花素和心脏纤维化的相关靶点，从BATMAM-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)中，Swiss ADME(http://www.swissadme.ch/)，PharmMapper (http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/ )数据库共获得284个与芒柄花素相关的靶点，通过GeneCards数据库获得3410个心脏纤维化相关靶点。我们将芒柄花素和心脏纤维化的靶点上传到Venny，发现有169个重叠靶点（表S7）（图4A），169个靶点的PPI网络如图4B所示。为了探索芒柄花素治疗心脏纤维化的新机制，我们还将来自KEGG的313个通路基因上传到Venny。从上述三个数据集的交叉点获得四个靶基因，即NOS2、ALDH2、HADH和MAOB（图4C），四个靶点的PPI网络如图4D所示。由于NOS2与其他三者没有直接联系，并且据报道，芒柄花素可调节NOS2，我们重点研究了芒柄花素对ALDH2、HADH和MAOB表达的影响。首先，我们检测ALDH2、HADH和MAOB在心肌细胞（CMs）和成纤维细胞（CFs）中的表达。结果显示，与CF相比，ALDH2、HADH和MAOB在CM中高度表达（图4E）。在CF中，HADH、MAOB和ALDH2的表达在用ISO处理后保持恒定（图S4A）。然而，在CM中，ISO处理后ALDH2和HADH的表达降低，而MAOB的表达增加。在用芒柄花素处理后，HADH、MAOB和ALDH2的表达趋于正常（图4F）。当用心肌细胞培养上清液处理CF时，MOAB的趋势与CM中的趋势相同（图S4B）。根据上述结果，我们用CM培养上清液孵育CFs。结果表明，在接受ISO处理CMs上清液的CFs中，胶原I、SMA和波形蛋白的蛋白表达升高。然而，用ISO加芒柄花素处理的CMs上清液未能诱导胶原I、SMA和波形蛋白的上调（图4G，H）。此外，我们在它们的mRNA水平上观察到了相同的趋势（图S5）。这些结果表明，芒柄花素直接作用于心肌细胞，心肌细胞调节成纤维细胞以改善心脏纤维化。

图4 通过代谢组学和网络药理学的整合，芒柄花素治疗心脏纤维化的靶点。（A）芒柄花素靶点和心脏纤维化相关靶点的维恩图谱；（B）来自芒柄花素和心脏纤维化的169个交叉靶点的PPI网络；（C）芒柄花素靶点、心脏纤维化相关靶点和代谢途径相关基因的维恩图谱；（D）PPI网络的4个核心靶点；（E）HADH、MOAB和ALDH2在CF和CM中的表达。所示数据为平均值±SEM；与CF相比，n=3，*p<0.05，**p<0.01。（F）CMs中HADH、MOAB和ALDH2 mRNA水平的实时PCR分析。所示数据为平均值±SEM；n＝6，与对照组相比*p < 0.05, * *p < 0.01，***p < 0.001；与模型相比，#p<0.05，##p<0.01，###p＜0.001。（G）用CM培养上清液处理CF中的collage I、а-SMA和波形蛋白水平进行蛋白质印迹分析；（H）定量分析CM培养上清液处理CF中collage I、а-SMA和波形蛋白的表达。所示数据为平均值±SEM；n=4，*p＜0.05，**p<0.01***p<0.001 vs.对照组，#p<0.05，##p<0.01，###p＜0.001 vs.模型组。

5. 芒柄花素减轻ISO诱导的线粒体功能障碍

由于HADH、MAOB和ALDH2都与线粒体功能有关，因此我们研究了芒柄花素对心肌细胞线粒体功能的影响。我们用JC-1荧光染色法检测CMs线粒体膜电位的变化。在正常条件下，JC-1主要积聚在线粒体基质中，形成JC-1聚集体并产生红色荧光。ISO使膜电位超极化，导致JC-1聚集体的减少和红色荧光信号的减弱。同时，去极化增加了JC-1单体的数量，从而增加了绿色荧光，这在很大程度上被芒柄花素逆转（图5A）。此外，我们还考察了芒柄花素对ROS产生的影响。ISO处理后ROS的产生显著增加，而芒柄花素显著抑制ROS的生成（图5B）。这些结果进一步表明，线粒体功能障碍是由芒柄花素介导的。

图5 芒柄花素通过改善线粒体功能障碍来治疗心脏纤维化。（A）JC-1双荧光法检测心肌细胞线粒体膜电位的变化；（B）芒柄花素减少线粒体中ROS的产生。CM中的代表性荧光图像。

心肌纤维化是一个主要的全球健康问题，几乎与所有类型的心脏病有关。心脏纤维化引起心室扩张、心肌肥大和细胞凋亡等病理变化，最终导致充血性心力衰竭的发展。心脏纤维化以细胞外基质（ECM）沉积为特征，可导致心脏功能受损和潜在的心脏损伤。ROS通过调节基质蛋白的表达和代谢，直接影响间质ECM的产生。参与心脏纤维化的大多数ROS来源于线粒体。因此，针对线粒体的治疗策略至关重要。例如，已经发现线粒体靶向抗氧化剂MitoQ通过靶向线粒体ROS介导的涉及TGF-β1、NADPH氧化酶4（NOX4）和Nrf2的信号通路来抑制压力超负荷心脏的纤维化。此外，Bendavia已经证明了其通过促进线粒体生物发生来改善线粒体功能障碍和缓解心脏纤维化的能力。此外，线粒体膜电位和膜结构损伤也是心脏纤维化的重要特征。研究报道，阿格列汀可通过减少线粒体ROS的产生、防止线粒体膜去极化和改善线粒体肿胀，有效缓解糖尿病兔间质纤维化。类似地，褪黑素和麻黄碱-4已经证明了它们通过保持线粒体膜的完整性和抑制细胞色素C的释放来减轻氧化应激和心脏纤维化的能力。在本研究中，我们研究了中药黄芪中的芒柄花素治疗心脏纤维化的疗效。首先，我们发现芒柄花素对治疗心脏纤维化是有效的。然后，我们将网络药理学与代谢组学相结合，来解释芒柄花素如何治疗心脏纤维化。接下来，我们发现了三个重要靶点，分别命名为ALDH2、HADH和MAOB。我们针对这三个靶点进行了一系列实验，以阐明芒柄花素治疗心脏纤维化的机制。

乙醛脱氢酶2（ALDH2）是一种线粒体酶，在调节细胞能量代谢中起着至关重要的作用。ALDH2主要参与醇衍生乙醛的解毒和氧化应激脂质过氧化产生的活性醛的代谢。它在心脏中大量表达，对心血管疾病具有保护作用。几项研究报道，ALDH2的激活改善了糖尿病大鼠的心脏收缩和舒张功能障碍，并减少了心肌损伤。此外，ALDH2敲除的小鼠表现出显著加重的心肌I/R损伤。先前的研究表明，ALDH2通过抑制氧化应激和炎症对高糖诱导的大鼠心肌细胞纤维化具有保护作用。此外，ALDH2酶活性的激活通过TGF-β1/Smad信号通路抑制心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。在我们的研究中，我们发现ALDH2的表达在ISO组中受到抑制，但在ISO+FH组中这种现象得到了改善。

单胺氧化酶（MAOs）位于线粒体外膜上，对神经递质和膳食胺的氧化脱氨基进行催化。MAOs有两种亚型，MAOA和MAOB，具有不同的底物。MAOB在小鼠和人的心肌中表达。组胺被MAOB降解为1N-甲基组胺，从而产生活性氧（ROS），在心脏损伤中起着关键作用。事实上，线粒体是MAO通过p53和过氧化物酶体增殖物激活的受体-γ共激活因子-1α或通过对这些细胞器的直接氧化损伤产生的活性氧的主要靶点。研究表明，心肌细胞中MAOB特异性缺失后，线粒体中ROS的产生显著减少，可以减少心肌缺血/再灌注损伤。在由横向主动脉收缩诱导的充血性心力衰竭的实验模型中，MAOB的整体丧失诱导心脏氧化应激、左心室重构和细胞凋亡的减少，同时保持心脏功能。肌动蛋白和原肌球蛋白是MAO产生的ROS靶点，这些蛋白质的氧化与左心室功能障碍的程度直接相关。此外，MAO活性还可以通过激活金属蛋白酶来触发细胞外基质重塑。在我们的研究中，体内结果显示ISO处理没有改变MAOB的表达，但在体外，我们发现ISO处理增加了MOAB的表达，而用芒柄花素预处理逆转了这一现象。

线粒体酶β-羟基酰基辅酶a脱氢酶（HADH）位于线粒体内膜的基质侧，是脂肪酸氧化的关键酶。HADH基因编码短链L-3-羟基酰基-CoA脱氢酶，并催化线粒体中脂肪酸氧化的第三阶段。HADH基因的突变在线粒体中产生功能缺陷的蛋白质，从而使得相关蛋白复合物功能异常，导致能量不足、活性氧（ROS）的过度产生和受损线粒体的积累。HADH表达减少会阻碍β-氧化并刺激脂肪酸的积累，从而导致脂肪酸代谢的重新编程。HADH与纤维化之间的关系很少被研究。在本研究中，我们使用定量实时聚合酶链式反应检测了ISO处理后心脏中HADH的表达，结果显示ISO处理后，心脏中HADH的表达降低，然而，通过芒柄花素预处理可以改善这种情况。

结论

总之，我们的研究首次证明了芒柄花素可改善ISO诱导的心脏纤维化。结合代谢组学和网络药理学，我们证明了芒柄花素调节心肌细胞中ALDH2、HADH和MAOB的表达，以改善线粒体功能障碍，并改善ISO诱导的心脏纤维化。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38070245/

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