中科院1区-扬州大学：黄芩苷和N-乙酰半胱氨酸通过TFAM调节胆碱代谢，减轻镉诱导的肝纤维化

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导读

镉是一种与多种肝脏疾病相关的环境污染物。黄芩苷和N-乙酰半胱氨酸具有抗氧化和保肝作用。然而，目前尚不清楚黄芩苷和N-乙酰半胱氨酸是否可以通过调节代谢来减轻镉诱导的肝纤维化，或者他们是否发挥协同作用。研究者使用黄芩苷、N-乙酰半胱氨酸或黄芩苷+N-乙酰半胱氨酸治疗镉中毒小鼠。本文研究了黄芩苷和N-乙酰半胱氨酸对镉诱导的肝纤维的影响及其作用具体机制。本研究使用C57BL/6J小鼠、AML12和HSC-6T细胞建立体外实验和体内模型，采用代谢组学检测黄芩苷和N-乙酰半胱氨酸对肝脏代谢的影响，结果显示，与对照组相比，镉组脂肪酸和氨基酸水平升高，胆碱和乙酰胆碱含量显著降低。黄芩苷和N-乙酰半胱氨酸减轻了镉引起的代谢变化。进一步研究表明，胆碱可以缓解镉诱导的肝脏炎症和纤维化。此外，镉显著促进了乳酸的细胞外渗漏，而胆碱则缓解了镉诱导的细胞膜结构破坏和乳酸渗漏。Western blotting结果显示，镉显著降低线粒体转录因子A(TFAM)和胆碱激酶α(CHKα2)水平，而黄芩苷和N-乙酰半胱氨酸逆转了这种作用。小鼠肝脏和AML12细胞中Tfam的过表达增加了CHKα2的表达和胆碱含量，从而减轻镉诱导的乳酸泄漏、肝脏炎症和纤维化。总体而言，黄芩苷和N-乙酰半胱氨酸比单独使用任何一种药物在更大程度上减轻了镉诱导的肝损伤、炎症和纤维化。TFAM是黄芩苷和N-乙酰半胱氨酸的靶标，通过调节肝脏胆碱代谢来缓解镉诱导的肝脏炎症和纤维化。

亮点：

1. 黄芩苷和NAC联合用药靶向代谢缓解Cd诱导肝纤维化。

2. 黄芩苷和NAC联合使用可通过TFAM调节胆碱代谢，稳定细胞膜结构，减少乳酸和炎症因子的释放，从而缓解Cd诱导的肝脏炎症和纤维化。

3.黄芩苷和NAC的联合使用疗效更好。

论文ID

原名：Baicalin and N-acetylcysteine regulate choline metabolism via TFAM to attenuate cadmium-induced liver fibrosis

译名：黄芩苷和N-乙酰半胱氨酸通过TFAM调节胆碱代谢，减轻镉诱导的肝纤维化

期刊：Phytomedicine

IF：7.9

发表时间：2024.01

通讯作者：邹辉

通讯作者单位：扬州大学兽医学院

实验设计

实验结果

1.黄芩苷和N-乙酰半胱氨酸（NAC）联合缓解镉（Cd）诱导的肝损伤

研究者首先研究了黄芩苷和NAC是否对Cd诱导的肝损伤具有保护作用。从形态学上看，镉处理小鼠的肝脏颜色暗淡，边缘肿胀，质地柔软，失去弹性。与Cd组相比，NAC+Cd组和黄芩苷+Cd组无肿胀。但黄芩苷+NAC+Cd组与NAC+Cd组和黄芩苷+Cd组相比无显著变化（图1A）。因此，研究者进一步检查了组织病理学变化。HE染色结果显示，与对照组相比，Cd组肝索排列紊乱、脂肪变性、炎性细胞浸润明显。NAC+Cd和黄芩苷+Cd减轻了Cd引起的部分病理损伤，但仍有部分炎性细胞浸润。与NAC+Cd组和黄芩苷+Cd组相比，黄芩苷+NAC+Cd组的检查参数有显著改善（图1B）。体重、肝脏重量和肝脏比重的结果也与肝脏形态学和组织学结果一致（图1C-E）。Cd组小鼠肝脏重量增加，但体重减轻，黄芩苷或NAC缓解了体重减轻和肝重量增加。黄芩苷和NAC联合使用进一步缓解了检查参数的变化，肝脏比重的结果也反映了体重和肝脏重量的变化；然而，黄芩苷和NAC的组合并没有进一步降低肝脏比重。天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和碱性磷酸酶（ALP）是肝功能的重要生化指标，其检测结果显示，与对照组相比，Cd组AST、ALT和ALP水平显著升高，黄芩苷或NAC不同程度地缓解了这些升高。黄芩苷和NAC的联合使用进一步降低了ALP的水平，但没有进一步降低AST和ALT水平（图1F-H）。

图1 黄芩苷和NAC联合使用可缓解Cd诱导的肝损伤。NAC+Cd组和黄芩苷+Cd组小鼠分别给予20 mg/kg黄芩苷和10 mg/kg NAC，同时给予50 mg/L镉溶液。(A) 肝脏形态学观察。(B) 使用HE染色观察肝脏组织病理学。小鼠肝脏重量（C）、体重（D）和肝脏系数（E）。根据血清AST（F）、ALT（G）和ALP（H）水平评估肝功能。结果显示为SD±平均值 (n = 3）。与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。与Cd组相比，#P < 0.05，##P < 0.01。与黄芩苷+NAC+Cd组相比，*P < 0.05，**P< 0.01。ns，不显著。NAC，N-乙酰半胱氨酸；HE，苏木精和伊红；ALP，碱性磷酸酶；ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶。

2.代谢组学表明，黄芩苷和NAC联合使用可缓解Cd诱导的代谢紊乱

肝脏是人体最重要的代谢器官之一；因此，本研究使用代谢组学来检测肝脏代谢的变化。结果表明，与对照组相比，Cd组整体代谢产物水平显著升高，主要包括脂质和部分氨基酸的增加。有趣的是，Cd组半乳糖胺增加，胆碱和乙酰胆碱水平显著降低（图2A）。随后，研究者对代谢物进行了KEGG分析，表明它们富含多种信号通路（例如，尼古丁成瘾、胆碱能突触以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢）（图2B）。为进一步验证代谢组学结果，研究者使用ELISA试剂盒检测胆碱和半乳糖胺的含量，结果显示，与对照组相比，Cd组半乳糖胺含量显著升高，胆碱含量显著降低。黄芩苷或NAC可缓解半乳糖胺的升高和胆碱的减少。黄芩苷和NAC的联合使用进一步增强了单独使用黄芩苷的效果（图2C-D）。

图2 黄芩苷和NAC联合缓解Cd诱导的代谢紊乱。(A)肝脏代谢谱的热图。（B） 富集的KEGG通路。用 5μM Cd、10μM 黄芩苷和 20μM NAC单独或组合处理细胞12小时，ELISA 测定胆碱（C）和半乳糖胺（D）的含量。结果显示为SD±平均值（n = 3）。与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。与Cd组相比，#P < 0.05，##P < 0.01。与黄芩苷+NAC+Cd组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。NAC，N-乙酰半胱氨酸；KEGG，京都基因和基因组百科全书;ELISA，酶联免疫吸附测定。

3. 黄芩苷与NAC联合缓解Cd诱导的肝脏炎症

考虑到炎症细胞浸润现象和小鼠组织病理学中检测到的炎症小体形成，研究者进一步检查了炎症相关指标。结果表明，Cd显著增加白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-18（IL-18）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的释放，而黄芩苷或NAC抑制这些炎症因子的释放。黄芩苷比NAC效果更好，黄芩苷+NAC进一步抑制炎症因子的释放（图3A-D）。Western blotting结果显示，Cd显著增加了NOD 样受体热蛋白结构域蛋白 3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和cleaved-caspase-1的水平；然而，单独使用黄芩苷或NAC并不能抑制这些蛋白质水平的增加。同时，给予黄芩苷+NAC的动物显示出对Cd增加的NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1水平的显著抑制（图3E）。随后，为了验证体内结果，研究者使用AML12细胞建立体外模型，检测IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α的释放以及NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1的水平。结果与体内实验结果一致：Cd增加了炎症因子的释放以及NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1的水平（图3 F-I），而黄芩苷+NAC减轻了Cd对炎症因子释放的影响以及NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1的水平（图3J）。

图3 黄芩苷和NAC联合使用可缓解Cd诱导的肝脏炎症。ELISA测定IL-1（A）、IL-18（B）、IL-6（C）和TNF-α（D）含量。使用蛋白质印迹法（E）测定NLRP3、ASC 和cleaved-caspase-1的水平。用 5μM Cd、10μM 黄芩苷和20μM NAC处理细胞。单独或联合使用，持续12小时。IL-1（F）、IL-18（G）、IL-6（H）和 TNF-α（I）含量的ELISA测定。（J）使用蛋白质印迹法测定NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1的水平。结果显示为 SD±平均值（n = 3）。与对照组比较，*P < 0.05，**P< 0.01。与Cd组相比，#P < 0.05，##P < 0.01。与黄芩苷+NAC+Cd组相比，*P < 0.05，**P< 0.01。ns，不显著。NAC，N-乙酰半胱氨酸;ELISA，酶联免疫吸附试验;IL，白细胞介素；TNF-α，肿瘤坏死因子α；NLRP3，NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3；ASC，凋亡相关斑点样蛋白。

4. 黄芩苷和NAC联合缓解Cd诱导的肝纤维化

Masson和天狼星红染色是显示组织胶原纤维的权威技术，进而揭示纤维化。结果如图4A和B所示。Cd组切片相对染色面积较对照组显著增加，且主要集中在肝窦和血管周围区域。黄芩苷或NAC减少了切片的相对染色面积，黄芩苷的作用比NAC更显著。黄芩苷+NAC进一步减少了切片的相对染色面积。血液生化指标也证实了染色结果，表明Cd显著增加了血凝素（HA）、层粘连蛋白（LN）、IV型胶原α1链（COL-IV）和III型前胶原肽（PIIINP）水平。然而，黄芩苷或NAC降低了评估参数的水平，在联合治疗组中进一步降低（图4C-F）。Western blotting结果显示，Cd显著提高了转化生长因子β（TGF-β）和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的水平，联合治疗可逆转这种变化（图4G）。为了验证 Cd 对肝纤维化的影响以及黄芩苷和 NAC的保护作用，研究者在体外模拟了AML12和HSC-T6细胞。CCK8检测结果显示，HSC-T6细胞直接暴露于Cd并未增加细胞的细胞活性（图4H）;然而，在Cd暴露后，将HSC-T6细胞暴露于AML12细胞上清液中会增加HSC-T6细胞的活性。黄芩苷和NAC单独或联合使用可缓解Cd诱导的HSC-T6细胞活性变化，细胞明场结果与CCK8实验一致（图4I-J）。本研究进一步检测了HA、LN、COL-IV和PIIINP的含量以及TGF-β和α-SMA的水平。结果与体内实验结果一致，黄芩苷或NAC减少了Cd处理的细胞上清液中HA、LN、COL-IV和PIIINP的含量以及TGF-β和α-SMA蛋白水平的影响，联合用药的治疗效果优于单独使用任何一种药物（图4k-O）。

图4 黄芩苷和NAC联合使用可缓解Cd诱导的肝纤维化。NAC+Cd组和黄芩苷+Cd组小鼠分别给予20 mg/kg黄芩苷和10 mg/kg NAC，同时给予50 mg/L镉溶液。Masson和Sirius肝组织染色的代表性图像（A-B）。比例尺 = 20μm，比例尺= 50μm。HA（C）、LN（D）、COL-IV.（E）和 PIIINP（F）含量的 ELISA 测定。（G）使用蛋白质印迹法测定TGF-β和α-SMA的水平。用 5μM Cd、10μM 黄芩苷和 20μM NAC单独或组合处理细胞 12小时，然后将AML12细胞培养基加入HSC-T6细胞中24小时。CCK8（H-I）、明场细胞分析（J）和COL-IV（N）和PIIINP（O）的含量。（K）使用蛋白质印迹法测定TGF-β和α-SMA的水平。结果显示为 SD±平均值（n = 3）。与对照组比较，*P < 0.05，**P< 0.01。与Cd组相比，#P < 0.05，##P < 0.01。与黄芩苷+NAC+Cd组相比，*P < 0.05，**P< 0.01。ns，不显著。NAC，N-乙酰半胱氨酸；ELISA，酶联免疫吸附试验；HA，血凝素；LN，层粘连蛋白；COL-IV，IV型胶原α1链；PIIINP，III型前胶原肽；TGF-β，转化生长因子β；α-SMA，α平滑肌肌动蛋白；CCK8，细胞计数试剂盒8。

5. 黄芩苷和NAC通过恢复胆碱代谢来保护膜结构的稳定性

如图5所示，Cd引起的总乳酸水平没有显著变化，而血清和细胞上清液中的乳酸和丙酮酸水平显著增加。黄芩苷或NAC降低了血清（图5A-C）和细胞上清液（图5E-G）中乳酸和丙酮酸的水平，联合处理进一步降低了乳酸和丙酮酸的含量。Western blotting结果显示，Cd显著降低了TFAM和CHKα2水平（图5D，I），黄芩苷和NAC单独或联合使用可缓解Cd诱导的TFAM和CHKα2水平降低。LDH释放实验结果表明，Cd暴露显著增加LDH释放，黄芩苷和NAC单独或联合使用可抑制Cd诱导的乳酸脱氢酶（LDH）释放（图5H）。最后，扫描电镜显示，与对照组相比，Cd处理后细胞膜结构被破坏，膜结构不完整，出现大面积裂纹。黄芩苷或NAC对Cd诱导的膜结构破坏有抑制作用，黄芩苷+NAC进一步减轻了膜结构的破坏（图5G）。

图5 黄芩苷和NAC的结合减轻了Cd诱导的细胞膜结构破坏以及乳酸和丙酮酸的泄漏。NAC+Cd组和黄芩苷+Cd组小鼠分别给予20 mg/kg黄芩苷和10 mg/kg NAC，同时给予50 mg/L镉溶液。这项研究首先检查了乳酸（A-B）和丙酮酸（C）水平。（D）TFAM和CHKα2水平用蛋白质印迹法测定。用 5μM Cd、10μM 黄芩苷和20μM NAC单独或组合处理细胞12 h，检测乳酸（E-F）和丙酮酸（G）的含量。乳酸脱氢酶释放（H）。采用western blotting检测TFAM和CHKα2水平(I)。扫描电镜观察细胞膜结构(J)。结果显示为 SD±平均值（n = 3）。与对照组比较，*P< 0.05，**P < 0.01。与Cd组相比，#P < 0.05，##P < 0.01。与黄芩苷+NAC+Cd组相比，*P < 0.05，**P< 0.01。ns，不显著。NAC，N-乙酰半胱氨酸；TFAM，线粒体转录因子A；CHKα2，胆碱激酶α；LDH，乳酸脱氢酶。

6. 胆碱是黄芩苷和NAC减轻Cd诱导的肝纤维化的主要靶点

结合代谢组学结果，研究者推测Cd的肝毒性与胆碱丢失密切相关。因此，研究者用胆碱和镉共同处理细胞，观察胆碱对镉毒性的影响。胆碱减轻了Cd诱导的AML12细胞活性降低（图6A）。细胞上清液中乳酸和丙酮酸的分析也表明，胆碱减轻了Cd诱导的乳酸和丙酮酸的泄漏（图6B-C），扫描电镜和LDH实验证明了胆碱对Cd诱导的细胞膜结构破坏的缓解作用（图6D-E）。随后，研究者发现胆碱显著降低了半乳糖胺的含量（图6F），抑制了AML12细胞中炎症因子（IL-1、IL-6、IL-18 和 TNF-α）的释放（图6H-K），并增加了NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1的水平（图6G）。胆碱和镉联合处理也降低了HSC-T6细胞活性的增加（图6L）。Western blotting结果显示，与Cd组相比，胆碱+Cd组TGF-β和α-SMA水平显著降低（图6M），胆碱+Cd组的HA、LN、COL-IV和PIIINP含量也明显低于Cd组（图6N-Q）。

图6 胆碱可缓解 Cd 诱导的肝脏炎症和纤维化。用5μM Cd 和10μM 胆碱单独或组合处理细胞12小时。使用CCK8（A）检测细胞活力。检测乳酸（B）和丙酮酸（C）的含量。（D）乳酸脱氢酶释放测量。（E）扫描电子显微镜观察细胞膜结构。（F）半乳糖胺含量的ELISA测量。（G）使用蛋白质印迹法测定NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1的水平。IL-1（H）、IL-18（I）、IL-6（J）和 TNF-α（K）含量的ELISA测定。用5μM Cd和10μM 胆碱单独或组合处理细胞12小时，然后将AML12细胞培养基加入HSC-T6细胞中24小时。CCK8测定（L），ELISA测定HA（N）、LN（O）、COL-IV（P）和PIIINP(Q)的含量。（M）使用蛋白质印迹测定TGF-β和α-SMA的水平。结果显示为SD±平均值（n = 3）。与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。与Cd组相比，#P < 0.05，##P < 0.01。CCK8，细胞计数试剂盒8；LDH，乳酸脱氢酶；ELISA，酶联免疫吸附试验；NLRP3，NOD样受体热蛋白结构域蛋白3；ASC，细胞凋亡相关斑点样蛋白；IL，白细胞介素；TNF-α，肿瘤坏死因子α；HA，血凝素；LN，层粘连蛋白；COL-IV，IV型胶原α1链；PIIINP，III型前胶原肽；TGF-β，转化生长因子β；α-SMA，α平滑肌肌动蛋白。

7. TFAM缺失是Cd诱导的肝纤维化的上游信号

在体内（图7 A-D）和体外（图7 F-I）过表达Tfam后，Cd诱导的血清和细胞上清液中炎症因子（IL-1，IL-6，IL-18和TNF-α）水平的增加受到显著抑制。最后，过表达Tfam并未显著降低NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1水平；然而，当与Cd处理联合使用时，Tfam的过表达显著抑制了Cd诱导的NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1水平的增加（图7E，J）。Masson和Sirius红染色检测肝纤维化程度，结果表明TFAM过表达可显著降低Cd诱导的染色面积增加（图8A-B）。与对照组相比，Cd组HA、LN、COL-IV和PIIINP含量显著增加（图8 C-F），而过表达Tfam后，Cd诱导的HA、LN、COL-IV和PIIINP含量增加明显逆转（图8 H-K）。此外，Cd显著提高了TGF-β和α-SMA水平，而Tfam过表达则逆转了TGF-β和α-SMA水平（图8G，L）。

图7 黄芩苷和NAC的联合使用通过TFAM缓解Cd诱导的肝脏炎症。ELISA 测定 IL-1（A）、IL-18（B）、IL-6（C）和 TNF-α（D）的含量。（E）使用蛋白质印迹法测定NLRP3、ASC 和Cleaved-Caspase-1的水平。在用Tfam OE处理24小时的基础上，将AML12细胞在有或没有Cd的情况下处理12 小时。ELISA测定IL-1（F）、IL-18（G）、IL-6（H）和 TNF-α（I）的含量。使用蛋白质印迹法测定NLRP3、ASC 和Cleaved-Caspase-1的水平（J）。结果显示为SD±平均值（n = 3）。与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。与Cd组相比，#P < 0.05，##P < 0.01。NAC，N-乙酰半胱氨酸；TFAM，线粒体转录因子A；ELISA，酶联免疫吸附试验；IL，白细胞介素；TNF-α，肿瘤坏死因子α；OE：过表达；NLRP3，NOD样受体热蛋白结构域蛋白3，ASC，凋亡相关斑点样蛋白；AAV8，腺相关病毒载体血清型8；NC，阴性对照。

图8 黄芩苷和NAC通过TFAM减轻Cd诱导的肝纤维化。（A-B）Masson和Sirius肝组织染色的代表性图像。比例尺 = 20μm，比例尺 = 50μm。HA（C）、LN（D）、COL-IV.（E）和PIIINP（F）含量的ELISA测定。（G）使用蛋白质印迹法测定TGF-β和α-SMA的水平基于用Tfam OE 处理 24小时，将AML12细胞用或不用Cd处理12 h。然后将AML12细胞培养基加入 HSC-T6细胞中24小时。HA（H）、LN（I）、COL-IV.（J）和PIIINP（K）含量的ELISA测定。使用蛋白质印迹法（L）测定TGF-β和α-SMA的水平。结果显示为SD±平均值（n = 3）。与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。与Cd组相比，#P < 0.05，##P < 0.01。NAC，N-乙酰半胱氨酸；TFAM，线粒体转录因子A；ELISA，酶联免疫吸附试验；HA，血凝素；LN，层粘连蛋白；COL-IV，IV型胶原α1链；PIIINP，III型前胶原肽；TGF-β，转化生长因子β；α-SMA，α平滑肌肌动蛋白；AAV8，腺相关病毒载体血清型8；NC，阴性对照。

8. TFAM通过CHKα2介导的胆碱代谢抑制乳酸和丙酮酸的泄漏

为了验证TFAM的作用，研究者使用AAV8-TFAM构建体建立了体内TFAM过表达的小鼠模型。结果表明，AAV8-TFAM+Cd组CHKα2水平较Cd组升高（图9 A），血清中乳酸和胆碱含量降低（图9 B-C）。以相同的方式处理AML12细胞，结果与体内实验的结果一致（图9 D-F）。研究者还使用LDH和扫描电子显微镜观察TFAM在Cd诱导的细胞膜结构破坏中的作用。结果表明，与Cd组相比，TFAM OE+Cd降低了Cd诱导的LDH释放和细胞膜结构破坏（图9G-H）。

图9 TFAM通过CHKα2介导的胆碱代谢抑制乳酸和丙酮酸的泄漏。（A）使用蛋白质印迹法测定 CHKα2 的水平。（B）检测乳酸的含量。（C）胆碱含量的ELISA测量。在Tfam OE处理24 h的基础上，分别对AML12细胞加Cd和不加Cd处理12 h，使用蛋白质免疫印迹法测定CHKα2的水平（D）。检测乳酸（E）的含量。胆碱含量的ELISA测量（F）。乳酸脱氢酶释放（G）。扫描电子显微镜观察细胞膜结构（H）。结果显示为SD±平均值 （n = 3）。与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。与Cd组相比，#P < 0.05，##P < 0.01。TFAM，线粒体转录因子A；CHKα2，胆碱激酶α；ELISA，酶联免疫吸附试验；OE：过表达；LDH，乳酸脱氢酶；AAV8，腺相关病毒载体血清型8；NC，阴性对照。

图10 原理图。这项研究表明，黄芩苷和NAC联合使用可协同缓解镉诱导的肝纤维化。胆碱代谢在其中起着重要作用。黄芩苷和NAC的联合使用可恢复胆碱代谢，稳定细胞膜结构，从而缓解纤维化。

环境镉污染的增加与工业冶炼生产的闪锌矿有关。人们在冶炼和电子相关行业从业人员以及冶炼厂周围的老鼠中发现了高含量的镉。除职业暴露外，饮食是人类和动物接触镉的主要途径。通过肠道吸收Cd的效率低（3-5%）；然而，镉的代谢周期很长（10-30年），一旦进入体内，就会固定在肝脏和肾脏等器官中，对身体造成严重损害。流行病学研究结果显示，镉暴露增加了肝坏死性炎症、非酒精性脂肪性肝病（NFALD）和非酒精性脂肪性肝炎的发生率和死亡率，但与肝癌死亡率没有显著的正相关关系。在这项研究中，镉暴露对肝脏造成损害，包括炎症和纤维化。

虽然肝纤维化发生进展的机制已基本了解，但目前尚无FDA批准用于临床治疗肝纤维化的有效药物;因此，开发治疗肝纤维化的有效药物是临床的迫切需求。以往的药物研究主要集中在调节糖脂代谢，抑制氧化应激、炎症和细胞凋亡，使用裂解酶-2等抗纤维药物，调节肠道菌群。然而，随着对中药的深入研究，研究者们已经认识到某些中草药也具有良好的保肝作用，并能抑制多种慢性肝病的发展， 如NFALD、NASH和肝纤维化。肝纤维化是指弥漫性细胞外基质，特别是胶原蛋白在肝脏内的过度沉积。细胞外基质主要由肝星状细胞产生。当肝脏受到重金属、酒精、病毒或其他化学药物的刺激时，肝星状细胞被激活，从而诱导肝纤维化的发展。研究表明，扶正化瘀方等中药配方通过调节AMPK信号通路，减少2型糖尿病仔猪的肝脂肪变性和纤维化。既往研究表明，调节IKKβ/NF-κB和TGF-β1/Smad信号通路可以预防小鼠的脂肪性肝炎和纤维化。黄芩苷和高丽红参通过抑制α-SMA、TGF-β和胶原蛋白（Col）-1的表达来阻碍肝纤维化的发展，然而，其机制尚不清楚。因此，在本研究中，研究者选择黄芩苷作为候选药物，结果表明黄芩苷可缓解Cd诱导的肝损伤、炎症和肝纤维化。由此可见黄芩苷对各种诱因引起的肝纤维化具有一定的保护作用。肝纤维的发生取决于多种机制的联合作用，目前治疗肝纤维化的单靶点药物具有明显的局限性。因此，使用联合治疗方案治疗NASH更合适和有益。NAC是半胱氨酸的前体，最初用作治疗扑热息痛中毒的标准护理药物，并被列入世界卫生组织的基本药物清单。此外，NAC通常与其他药物联合使用以提高其有效性。研究表明，NAC通过与菠萝蛋白酶结合增强化疗药物的疗效，并能协同减轻顺铂与番茄红素的毒性。因此，在本研究中，研究者选择黄芩苷和NAC来探讨其联合使用对Cd诱导纤维化的影响，并确定联合使用是否具有协同作用。结果表明，黄芩苷和NAC联合使用可缓解Cd诱导的肝损伤、肝脏炎症和肝纤维化的发展。此外，该组合比单独使用任何一种药物具有更好的效果。黄芩苷与NAC联合使用对抗Cd肝毒性有协同作用。

肝脏是人体的主要代谢器官。代谢失衡与胰岛素抵抗、糖尿病、脂肪肝、肝纤维化、肝癌等疾病的发生发展密切相关。因此，维持肝脏的正常代谢功能至关重要。大多数肝脏疾病缺乏明确的代谢标志物，这是诊断肝脏疾病和寻找靶向药物的重要障碍之一。既往研究表明，不同的肝脏疾病都伴有代谢紊乱，主要集中在糖代谢、脂质代谢、氨基酸代谢、尿素循环、胆汁酸代谢、胆红素代谢、糖异生、炎症和免疫反应等方面。研究者们在大多数肝脏疾病中观察到乳酸的增加，其中有氧代谢受阻；因此糖酵解和磷酸戊糖途径成为主要的葡萄糖代谢途径。糖酵解可以产生大量的乳酸，导致高乳酸水平。然而，在这项研究中，研究者发现Cd并没有显著增加肝脏中乳酸的含量，而是增加了其在血清中的含量，黄芩苷和NAC的组合缓解了血清乳酸的这种增加。本研究在体外观察到相同的结果，并且使用扫描电子显微镜（SEM）也观察到肝细胞膜结构的破坏。这表明乳酸释放的增加可能是由肝细胞膜结构的破坏引起的。研究者在不同肝脏疾病的代谢物分析中也发现了胆碱代谢相关产物（如磷脂酰胆碱和溶血卵磷脂）的减少。磷脂酰胆碱参与脂蛋白组成，并在维持细胞膜功能中起重要作用。然而，虽然研究者没有观察到磷脂酰胆碱的显著降低，但确实观察到了胆碱和乙酰胆碱的显著降低，这可以通过黄芩苷和NAC联合治疗来缓解。胆碱是一种必需的营养素，肝脏是负责胆碱代谢的中枢器官。当身体缺乏胆碱时，就会发生肝脂肪变性和肝细胞死亡。黄芩苷+NAC组减轻了Cd引起的肝纤维化损伤，为了验证胆碱在其中的作用，研究者用胆碱和Cd共处理细胞和小鼠。结果表明，胆碱显著缓解了Cd诱导的肝细胞膜结构破坏和乳酸释放，减轻了肝脏炎症和纤维化。磷脂酰胆碱和胆碱是可相互转化的，胆碱通过CHKα2转化为磷脂酰胆碱。胆碱还促进谷胱甘肽的合成，谷胱甘肽发挥抗氧化作用。研究表明，镉会导致谷胱甘肽消耗，这可能是由胆碱缺乏引起的。先前的研究表明，胆碱等物质的损失是由磷脂酰胆碱的损失引起的。本文仅观察到胆碱的丢失，表明在Cd诱导的肝病中还有其他调节胆碱代谢的机制。NAFLD、非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化涉及线粒体功能的丧失。TFAM是线粒体蛋白基因的转录因子，可促进线粒体的产生。研究者在胆碱-蛋氨酸缺乏饮食诱导的NAFLD中也发现了TFAM的缺乏。因此，研究者推测TFAM可以调节胆碱代谢，以缓解Cd诱导的肝纤维化。研究者发现Cd显著降低了TFAM和CHKα2水平，这可以通过黄芩苷+NAC逆转。此外，Tfam的过表达抑制了Cd诱导的CHKα2水平下降，缓解了Cd诱导的胆碱丢失、乳酸渗漏、肝脏炎症和肝纤维发育。因此，黄芩苷+NAC可以通过TFAM调节胆碱代谢，从而减少乳酸和炎症因子的释放，缓解Cd诱导的肝纤维化。

结论

本研究揭示了黄芩苷和NAC联合靶向代谢缓解Cd诱导的肝纤维化的详细机制，为研究靶向代谢策略保护重金属中毒提供了新的途径。结果证明，黄芩苷与NAC联合使用可通过TFAM调节胆碱代谢，稳定细胞膜结构，减少乳酸和炎症因子的释放，从而缓解Cd诱导的肝脏炎症和纤维化。此外，与单独使用相比，黄芩苷和NAC的联合用药具有协同作用。本研究还揭示了脂肪酸和氨基酸等代谢物的变化，这可能与肠道等器官有关，这也是研究者及其团队下一步探索黄芩素和NAC对Cd毒性的保护作用和机制的研究方向。

原文链接： https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0944711324000023#sec0015