《食品科学》：内蒙古农业大学陈永福研究员等：锡林郭勒鲜牛乳中乳酸菌分离鉴定及微生物多样性分析

生鲜乳作为原料乳进一步加工成发酵乳或奶酪等产品，通过微生物多样性分析，可以知晓生牛乳中腐败菌以及致病菌的种类，还能够知晓生牛乳中有益菌的菌种，这些有益菌直接与发酵乳制品风味和有益功能代谢物的形成有关。基于纯培养的方法仅能获得样品中可培养微生物的信息，不能全面反映样品中微生物的组成。为了更全面准确评估乳制品的微生物多样性，各类分子生物学技术被广泛使用。宏基因组学是通过提取样品中全部微生物的DNA进行测序，不仅可以在宿主相关群体中快速、准确地完成微生物在种水平的多样性分析而，且可以完成微生物在种水平的功能组成分析。

内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室孙洁，苏 茜，陈永福等选择位于内蒙古锡林郭勒西北部和东北部的苏尼特左旗和东乌珠穆沁旗为采样地点，分别采集当地牧民日常食用的新鲜牛乳。采用传统分离鉴定和宏基因组学相结合的方法，对锡林郭勒盟鲜奶中微生物多样性进行研究。并选择宏基因组常见的HUMAnN2分析流程，采用分层式检索策略和比对泛基因组的方法鉴定群体的已知物种，通过翻译检索未分类的序列，快速、准确定量基因家族和代谢通路，以期在丰富菌种资源库、扩充少数民族微生态数据库的同时，为生鲜牛乳的开发和利用提供理论依据。

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鲜奶中微生物群落结构和功能解析

1.1 鲜奶中微生物组成及差异分析

使用Illumina Novaseq6000平台对文库制备物进行测序，6 份鲜奶样的宏基因组下机数据量，分别是6.7、4.7、5.3、4.8、7.6 G和5.1 G，采用分层式检索策略，去除奶牛宿主后，实际数据量分别是6.2、4.5、5.1、4.2、7.0 G和5.0 G。使用生科云（https://www.bioincloud.tech/）软件，对鲜奶中微生物结构与组成进行解析。

通过Shannon指数（图1A）和Simpson指数（图1B）评估样本中微生物的多样性和丰富度，指数越大，多样性越高。基于Bray-Curtis距离（图1C）和欧氏距离（图1D），并选取贡献率最大的主坐标组合进行主坐标分析（PCoA），经Wilcoxon test配对检验发现两地鲜奶样品的差异并不显著（P＞0.05）。可见，苏尼特左旗和东乌珠穆沁旗的鲜奶样，物种丰富度没有显著差异，物种组成和结构也未明显分开，再经正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）（图1E）可以看出较明显的差异，表明两地鲜奶中存在各自的特有物种。

如图2所示，苏尼特左旗和东乌珠穆沁旗的 6 个鲜奶样，共鉴定 到 8 个细菌门、 99 个属、 165 个种，优势菌种隶属于厚壁菌门（ Firmicutes ， 52.26% ）、乳球菌属（ Lactococcus ， 33.11% ）的乳酸乳球菌（ Lactococcus lactis ， 33.02% ），其次为肠系膜明串珠菌（ Leuconostoc mesenteroides ， 9.40% ）。

两地共有物种64 种，占总物种丰度的43.74%，特有物种各50 种，如图3所示，Venn图揭示了微生物在两个栖息地之间的重叠和划分，近60.98%的物种被确定为唯一的物种，即仅在一个地区中检测到。共有微生物L. lactis、L. mesenteroides、乳球菌噬菌体ul36（Lactococcus phageul36）和约氏不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）等占主导优势。尽管两地独特的物种占总物种比例很大，但它们的相对丰度非常有限，这表明它们在微生物群落中处于不利地位，苏尼特左旗的特有优势物种为乳球菌噬菌体BM13（Lactococcus phage BM13）、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）等，东乌珠穆沁旗的优势物种为肠杆菌亚种MGH8（Enterobacter sp. MGH8）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）等。

1.2 牛奶中微生物多样性及功能分析

如图4所示，使用HUMAnN（V2.0）软件对鲜奶中微生物的功能进行解析，Uniprot数据库注释到1 408 048 个基因，然后将同源性大于50%的非冗余序列信息聚集在一起，得到412 条代谢通路。氨基酸合成和降解代谢功能丰度最高，其次为糖酸转化和氧化反应。硝酸盐反应、碳氮循环、嘧啶回收、糖酵解和呼吸作用也是较为丰富的代谢通路。与微生物组成相似，苏尼特左旗的一个样品（AM21）与东乌珠穆沁旗的一个样品（AM60）代谢通路丰度基本一致，即6-羟基甲基二氢二磷酸生物合成丰度最高，丙酮酸发酵生成乙酸和乳酸II次之，而剩余4 个样品其他代谢通路较多，组成更为丰富。另外，在排名前20的代谢通路中，除了AM60样品不含L-精氨酸生物合成I（通过L-鸟氨酸）外，所有样品代谢通路种类一致。而S-腺苷蛋氨酸-L-甲硫氨酸循环代谢途径在除AM60样品以外的其他样品中含量较少。

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乳酸菌分离鉴定结果分析

2.1 乳酸菌分离纯化结果

根据宏基因解析结果决定对细菌菌株进行分离鉴定，然后对乳酸菌进行入库保藏。获得颜色为白或淡黄，表面呈粗糙或光滑，形态为圆形或椭圆形的菌株55 份（图5A）。经革兰氏染色检验（图5B），为紫色球形、链球、长杆、短杆等。再经过PCR，得到如图5C的扩增条带。

2.2 菌株鉴定结果

将6 份鲜奶样中分离菌株的16S rRNA基因序列与NCBI数据库中已有菌株的16S rRNA序列进行同源性比对后，共得到47 株菌，如图6A所示，其中66%为L. lactis，9%为耐久肠球菌（E. durans），5%为L. mesenteroides、4%为假肠膜明串珠菌（L. pseudomesenteroides），2%为开菲尔乳杆菌（L. kefiri）。此外还鉴定出7 株非乳酸菌。用MEGA11构建系统发育树，同源性分析结果与菌株分离鉴定结果基本一致，如图6B所示，有35 株菌的16S rRNA基因序列与L. lactis模式株序列同源性为100%，被鉴定为L. lactis，同理鉴定到3 株E. durans，1 株L. kefiri，1 株苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis），同源性均为 100 % 。鉴定到 L. mesenteroides 和L. pseudomesenteroides各2 株，解鸟氨酸拉乌尔菌（R. ornithinolytica）、格里蒙克雷伯菌（K. grimontii）、产酸克雷伯菌（ K. oxytoca ）、巴氏克雷伯氏菌（K. pasteurii）各1 株，同源性均大于98%（图6B）。

通过传统分离鉴定的方法结合宏基因组策略，解析了内蒙古锡林郭勒苏尼特左旗和东乌珠穆沁旗物种组成。在门水平上，发现Firmicutes和变形菌门（Proteobacteri）为优势菌门，Firmicutes含量远高于拟杆菌门（Bacteroidetes）。属水平上，Lactococcus作为牛乳中的优势菌属，产酸凝乳，并产生良好的芳香气味，不仅在许多发酵食品的生产中用作发酵剂和辅助培养物，还发挥着重要的保护作用，抑制或减少牛奶中病原体微生物，可以在很大程度上提高牛奶的质量。同时，鲜牛乳中还有Acinetobacter和Klebsiella等条件治病菌属检出。尽管在宏基因测序时去除了奶牛宿主的污染，这种经典的牛奶取样方法可能还是会受到暴露于环境中的乳头皮肤和乳头尖端附近区域细菌的影响。但是，也不能排除牛奶中本身就含有这两种菌的可能。种水平上，传统分离鉴定方法得到优势菌种为L. lactis、E. durans、L. mesenteroides、L. pseudomesenteroides和L. kefiri，宏基因二代测序也可以得到同样的结果，由于培养基和培养条件的限制，宏基因测序方法还检测到一些传统分离方法未培养到的菌种，如溶酪大球菌（Macrococcus caselyticus），这是大球菌属中研究最多的一类，与发酵食品香气和风味的形成有关，因此被用作发酵的发酵剂，但是，在发酵中使用这些微生物时，必须考虑到食品安全的一些重要问题。这些菌种在丰富鲜奶口味的同时，为改善人体健康做出巨大贡献。

分离鉴定到的乳酸菌均已保藏，用来扩充内蒙古少数民族聚集地乳酸菌数据库。同时本研究还探讨了锡林郭勒的两个旗县，苏尼特左旗和东乌珠穆沁旗的微生物之间的差异性，发现两地大量物种为共有物种，东乌珠穆沁旗的优势物种为Enterobacter sp. MGH8，是人体的条件致病菌；可存在于昆虫体内，侵染并杀死昆虫；还可侵染植物。此外，还可作为生物农药、固氮微生物等，对植物代谢、植物生长、有害生物防治等起着积极作用。这些物种的鉴别可以为乳制品安全性评价提供有力依据，也对牛乳的商业价值与地理区域之间的关系提供了有趣的见解。

通过宏基因功能分析发现，苏尼特左旗和东乌珠穆沁旗的鲜奶样品代谢通路种类基本一致，含量却相差较大，因此功能也不尽相同。推测两地微生物可能有着共同的祖先，但随着时间的推移和生物的进化，两地奶牛可能产生了不同的生活方式，饮食结构也随之发生了改变。检测到的代谢通路主要用于乳酸酯类、乳酸醇类和乳蛋白的合成，丙酮酸发酵生成乙酸和乳酸途径丰度较高是因为牛乳中抗氧化作用极强的丙酮酸含量较高，且丙酮酸有助于乳酸乳球菌细胞的防御系统，获得更高的生物量，促进Nisin产生。而乳酸菌存在的生理活性与细胞壁中的肽聚糖有关，乳酸菌肽聚糖水解溶液具有低黏度、低pH值的性质，可能使得溶液pH值下降；具有抗氧化功能，肽聚糖水解后的抗氧化能力与谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸等显著相关。锡林郭勒鲜奶中肽聚糖成熟代谢功能占主导地位，因此，本研究可为此类有益菌的筛选提供依据。同时，研究也发现苏尼特左旗和东乌珠穆沁旗的鲜奶中各类氨基酸生物合成代谢途径丰度较高，如L-苏氨酸，作为一种必需氨基酸被广泛用于食品、饲料、医药及化妆品行业，甘氨酸和丝氨酸则用于治疗各种临床疾病。

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结 论

基于宏基因组测序分析，苏尼特左旗和东乌珠穆沁旗6 份鲜奶样品共鉴定出微生物菌种165 个，优势菌种为L. lactis和L. mesenteroides。两地鲜奶中共有微生物物种较多，致使α、β多样性无明显差异，但两组鲜奶中仍存在明显差异物种。苏尼特左旗以Lactococcus phage BM13为主，东乌珠穆沁旗以Enterobacter sp. MGH8为主。经Uniprot数据库注释，鲜奶功能集中在氨基酸代谢与糖酸代谢。同时，从6 份鲜奶样品共分离出47 株菌，乳酸乳球菌为优势菌种，占总分离株的65.96%，与宏基因组结果一致。该研究解析了锡林郭勒少数民族聚集地鲜乳中的微生物多样性，可为发酵乳制品的安全生产及优质乳酸菌资源库的建立提供积极引导。

本文《锡林郭勒鲜牛乳中乳酸菌分离鉴定及微生物多样性分析》来源于《食品科学》2023年44卷第18期175-182页。作者：孙洁, 苏茜, 杜萍, 等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221030-303。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：美娟；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。