《食品科学》：上海理工大学杨昳津副研究员等：解脂耶氏酵母产赤藓糖醇研究进展

解脂耶氏酵母（ Yarrowia lipolytica ）是一种可利用多种底物发酵生产不同产品的非常规酵母，属于半子囊菌纲、耶氏酵母菌属，其全基因组测序和注释已完成，共有6 条染色体，基因组全长为20.5 Mb，G＋C相对含量为49%。 Y . lipolytica 在自然界中分布广泛，通常存在于富含脂质和烷烃等疏水性底物的环境中，其环境适应性强，可耐受高盐、低温以及过高的酸碱环境，易培养、安全性高，这些特性使其在工业中应用非常广泛。

赤藓糖醇是一种多元醇，其甜度为蔗糖的60%～70%，热量为0.84 kJ/g，仅为蔗糖热量的5%，可作为蔗糖的替代甜味剂。赤藓糖醇可由化学合成法和微生物发酵法进行生产，微生物发酵法不仅可消除化学合成法的弊端，还有生产条件温和、产品质量稳定、食品安全性高等优势。在微生物发酵法中，酵母菌是最常用于生产发酵赤藓糖醇的菌种，如耶氏酵母属（Yarrowia）。

上海理工大学健康科学与工程学院的李砷、牟志勇、杨昳津*等人 从发酵基质利用、发酵过程控制以及代谢途径改造三个方面对提升解脂耶 氏酵母对赤藓糖醇产量方面研究进行综述，以期为今后提高赤藓糖醇产量提供研究思路与参考。

1 解脂耶氏酵母生产赤藓糖醇的发酵基质利用

1.1 碳源的利用优化

目前，用解脂耶氏酵母生产赤藓糖醇主要的碳源有葡萄糖和甘油。二者相比，以葡萄糖作为碳源时，赤藓糖醇产率较高，但副产物较多；以甘油为底物时，虽然产量略低，但副产物较少，可获得的赤藓糖醇和副产物比率更高。 然而，以葡萄糖和甘油为底物生产赤藓糖醇不仅成本较高，还不利于我国绿色可持续发展理念的开展。所以近些年研究者致力于开发出如粗制甘油、废弃食用油（WCO）等可替代碳源。

在发现的可替代碳源中，粗制甘油使用较多。粗制甘油是生物柴油工业生产中的副产物，将其作为碳源生产赤藓糖醇的产量虽略低于对照组，但从经济成本与环境因素角度考虑，这无疑是更好的选择。此外，Y. lipolytica利用粗制甘油生产赤藓糖醇的优势非常明显，其不仅能够在化学成分复杂的粗制甘油中顺利生长，且粗制甘油中含有的一些其他化合物，如氢氧化钠、氯化钠、Ca或K，也可被Y. lipolytica利用以提高赤藓糖醇产量，将其作为碳源应用到赤藓糖醇生产中既可有效降低生产成本，还可为生物柴油工业解决处理废弃副产物。

除粗制甘油外，WCO也可被利用，研究证明解脂耶氏酵母可利用WCO作为替代碳源生产赤藓糖醇，这是由于解脂耶氏酵母具有可在油脂中生长的特性，也从侧面印证Y. lipolytica的许多特性非常适合生产赤藓糖醇；此外，该方法产生赤藓糖醇的同时也会产生脂肪酶，脂肪酶的产生同样需要消耗WCO，这正是利用WCO作为碳源得到赤藓糖醇产量不及以葡萄糖和甘油为底物的重要原因之一。

1.2 氮源的选择利用

常用的氮源主要是无机氮源铵盐和有机氮源酵母提取物，究表明，氮源中的硫酸铵和酵母提取物都会有利于提高赤藓糖醇产量，但综合多种成本、产量等因素，认为硫酸铵更适合于工业生产，且硫酸铵添加量为4.6 g/L时对提高Y. lipolytica Wratislavia K1菌株的赤藓糖醇产率效果最好。

1.3 培养基中其他营养素

除培养基主要营养成分外，培养基中存在的矿物质、表面活性剂和维生素等其他营养素也可能影响赤藓糖醇的产量。

通过添加金属离子来改变细胞的通透性，可增加赤藓糖还原酶（ER）活性。不同的金属离子有不同的影响，已有研究表明，Cu 2＋ 和Zn 2＋ 的添加可以增加ER活性，从而提高赤藓糖醇产量，而Mn 2＋ 通过改变细胞膜通透性来提升产量。 此外，金属离子的浓度也对赤藓糖醇产量有影响。

表面活性剂可能对赤藓糖醇生产产生多种影响。Magdalena等在解脂耶氏酵母甘油发酵的培养基中加入表面活性剂TritonX-100、Span 20和Tween 80，实验发现，加入0.25 g/L的Span 20后，赤藓糖醇产量增加15%，达到142 g/L，产率从0.62 g/（L·h）提高到1.1 g/（L·h）。然而，较高添加量的Span 20或补充其他的表面活性剂会对赤藓糖醇生产造成不利影响。

维生素也可能对赤藓糖醇的产生具有影响，如Tomaszewska等发现硫胺素对利用Y. lipolytica生产赤藓糖醇有影响。但是有研究表明，核黄素、生物素和叶酸等维生素会降低赤藓糖醇的产量，这类维生素对赤藓糖醇的产生有抑制作用，因此应控制其添加量。

2 解脂耶氏酵母生产赤藓糖醇的发酵过程控制

2.1 发酵工艺的影响

不同的发酵方式对解脂耶氏酵母生产赤藓糖醇的最终产量有显著影响（表2），生产中主要应用分批补料发酵和反复分批发酵两种方式。在分批补料发酵中，不同菌种所产生的副产物种类与产量不同，这可能是导致赤藓糖醇产量差异的原因之一。分批发酵虽然具有操作简单的特点，但其生产赤藓糖醇的浓度普遍较低，所以要进行分批补料发酵，以保持底物浓度维持在较高浓度水平上。与传统的分批发酵相比，反复分批发酵通过延长有效的生产阶段，可以获得更好的动态性和更高的生物合成效率，从而提高赤藓糖醇的产量并抑制副产物的产生。

2.2 发酵条件的影响

在发酵过程中渗透压、温度、pH值、溶氧量等培养条件对赤藓糖醇产量都有显著影响。当以葡萄糖为底物时，优化后的最佳pH值偏中性；而以甘油为底物时，最佳pH值偏小。通气速率也会对产量有影响，使用Y. lipolytica Wratislavia K1发酵时，最佳通气速率为1.08 L/min，比通气速率0.6 L/min条件下的产量高（表3）。研究发现，提高葡萄糖浓度有利于酵母大量合成赤藓糖醇。但随着底物浓度的上升，渗透压便成为一种环境胁迫因素，将对酵母细胞生长和代谢产生影响，那么如何使产物产率和酵母生产强度共同提高是目前需解决的问题。

已有研究表明，渗透压胁迫是影响赤藓糖醇产量的关键因素之一，渗透压主要可通过调节底物浓度和添加额外的盐进行调节。提高渗透压可促进赤藓糖醇产量增加，减少副产物，然而渗透压也不是越高越好。一般地，酵母细胞在发酵初期易受到渗透压的影响出现发酵被抑制或停滞的现象，从而导致发酵效率下降。为解决这一问题，Yang Libo等在利用解脂耶氏酵母分批补料发酵生产赤藓糖醇时，首次采用两阶段调控渗透压的方法，将发酵过程分为两个不同渗透压的阶段以维持赤藓糖醇的高生产速率，第一阶段（菌体生长阶段，0～96 h）通过补充底物甘油维持渗透压为4.25 Osmol/kg来减少高渗透压对酵母生长的抑制，而后在对数生长期结束时（96 h）停止补充甘油；第二阶段，132 h以后控制渗透压为4.94 Osmol/kg，以维持赤藓糖醇的高生产速率，发酵完成后赤藓糖醇产量达194.3 g/L，产率达0.95 g/（L·h），分别比单一阶段补料发酵方法提高25.7%、2.2%。由此可见，渗透压是发酵生产赤藓糖醇中的重要参数，控制在最佳渗透压可实现赤藓糖醇的高产率和高生产强度的统一。由此可见，解脂耶氏酵母生产赤藓糖醇时，甘油不仅可作为底物，还可作为渗透压调节剂使用。

2.3 生产菌种的选育

为得到产赤藓糖醇的优质解脂耶氏酵母菌株，研究人员主要采用自然分离筛选、诱变育种和基因工程改造3 种方法进行选育。研究逐渐发现利用自然分离筛选的方法提取的菌株生产赤藓糖醇的产量较低，因此，近些年采用其他方法如诱变育种等手段处理自然分离的菌株以获得更高产的菌种，从而提高赤藓糖醇产量，并取得了良好效果。

化学诱变剂一般通过使酵母碱基烷基化、使DNA复制时产生碱基错配等方式使关键酶基因突变从而改变其性状，虽然其具有成本低、效果好等优点，但现阶段使用的大部分化学诱变剂具对人体有一定损伤；而物理诱变是通过紫外线、等离子体等技术使关键酶基因的DNA分子链发生断裂引起损伤从而导致突变，其具有操作简单、安全性高、无污染等优点，所以物理诱变育种比化学诱变育种应用更广泛。

综上，诱变选育仍是获得优良菌株的重要方式，但其有一些不足之处，如诱变的方向和性质无法控制、有利变异较少等，若想克服这些缺点并在此基础上进一步提高赤藓糖醇产量，则需结合其他方法如优化发酵过程和改造代谢途径等共同作用。

3 基于代谢途径的基因工程改造

3.1 解脂耶氏酵母产赤藓糖醇代谢途径

通常，工业上解脂耶氏酵母生产赤藓糖醇主要以葡萄糖和甘油为底物，而不同底物发酵生产赤藓糖醇的代谢途径亦不同（图1）。解脂耶氏酵母经过磷酸戊糖途径的氧化与非氧化途径生成赤藓糖醇，当以葡萄糖为底物时，葡萄糖在葡萄糖激酶的催化下转变成6-磷酸葡萄糖后直接进入磷酸戊糖氧化途径，再通过6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、核酮糖磷酸-3-差向异构酶以及转酮酶（TKL1）的作用下经过磷酸戊糖氧化与非氧化阶段最后合成赤藓糖醇。而以甘油为底物时，甘油在甘油激酶（GK）、甘油-3-磷酸脱氢酶（GDH）以及磷酸甘油醛异构酶（TPI1）的作用下，先转化成3-磷酸甘油醛进入糖酵解途径，3-磷酸甘油醛在该途径中经醛缩酶、果糖-1,6-双磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（GND1）的催化下生成6-磷酸葡萄糖后进入磷酸戊糖氧化途径最终生产赤藓糖醇，在此过程中，中间产物丙酮酸进入三羧酸循环。Niang等研究发现，赤藓糖醇可以进一步在赤藓糖醇脱氢酶（EYD1）的催化作用下被降解为赤藓酮糖，赤藓酮糖又可在赤藓酮糖激酶（EYK1）和赤藓酮糖磷酸异构酶的催化作用下转化成成赤藓酮糖磷酸，赤藓酮糖与赤藓酮糖磷酸均可被细胞利用。

3.2 赤藓糖醇代谢途径改造

与传统的菌种选育相比，通过定向改造代谢途径来提高赤藓糖醇产量的代谢工程方法具有很多优点，如周期短和效率高等，因此近些年来应用此方法优化解脂耶氏酵母产赤藓糖醇产量的研究较多。

大量研究表明，磷酸戊糖途径对赤藓糖醇的合成至关重要（表4）。代谢途径中决定赤藓糖醇终产量的限速步骤可能在代谢途径起点，也可能在代谢途径终点，未来仍需深入研究磷酸戊糖途径对解脂耶氏酵母产赤藓糖醇的影响与调控机制。

赤藓糖醇合成的关键酶基因有很多，单个过表达可能有一些局限性，协同调控多个基因可能提高赤藓糖醇的最终产量，有研究采用多个基因组合过表达的方式以进一步提高赤藓糖醇产量。

敲除分解赤藓糖醇途径的基因与过表达关键酶基因均可提高赤藓糖醇产量，有研究者试图将二者结合以提高赤藓糖醇产量（表4）。 上游启动子或转录因子等元件因可调控关键酶基因进而也可影响赤藓糖醇产量。

综上所述，在解脂耶氏酵母生产赤藓糖醇研究中，代谢途径改造是一种非常有效的提高产量的方法。然而在目前的研究中，使用此法改造的多是解脂耶氏酵母W29和Polf等产量较低的菌株，对工业菌种的代谢途径改造相对较少。因此，在未来的研究中可将其应用在工业菌种上，提高工业赤藓糖醇的产量。

4 结 语

赤藓糖醇是一种健康甜味剂，具有很多优点，在人们越来越注重健康生活方式的今天，其需求在不断增长，且其在食品工业的应用将有望改善过量摄入糖带来的危害。因此，如何高效、低成本生产赤藓糖醇成为研究关键。目前，赤藓糖醇主要由酵母菌发酵生产，其中解脂耶氏酵母是主要的菌种。近年来，研究者们通过发酵基质选择、发酵过程控制以及代谢途径改造等方法来提高赤藓糖醇产量，均获得有效成果。即使如此，解脂耶氏酵母合成赤藓糖醇的研究还面临许多问题需进一步探索，比如诱变育种提高产量与代谢途径中关键酶突变导致的酶活性提高有关，未来可探究体外定向进化提高关键酶的活性，而应用反向代谢工程在胞内表达进化后的酶，从而达到提高赤藓糖醇产量的效果；目前已有学者发现，耐高温的解脂耶氏酵母菌株赤藓糖醇产量更高，但其分子作用机制尚不清楚，有待继续探索；目前已知渗透压对解脂耶氏酵母代谢合成赤藓糖醇具有重要影响，但潜在的分子机制尚不清楚，还需进一步探索研究。

通信作者：

杨昳津副研究员

杨昳津（1991—）（ORCID: 0000-0002-8591-6258），女，副研究员，博士，研究方向为优良食品微生物选育及功能机制解析。

第一作者：

李砷硕士研究生

李砷（1999—）（ORCID: 0000-0002-8058-2594），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物及其作用机制研究。

本文《解脂耶氏酵母产赤藓糖醇研究进展》来源于《食品科学》2023年44卷17期196-203页. 作者：李砷，牟志勇，严鑫，艾连中，夏永军，宋馨，田延军，张辉，倪斌，杨昳津. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220830-351. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。