液体活检在H3K27M弥漫中线胶质瘤中的应用

引言

具有H3K27M突变的弥漫性中线胶质瘤（DMG）是一种具有侵袭性且难以治疗的儿童脑肿瘤。H3K27改变的弥漫性中线胶质瘤（DMG）是2021年世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类（WHO CNS5）最新定义的实体，是一种高级别胶质瘤，最常见发生于中线结构，如脑干、丘脑或脊髓。这些肿瘤常累及重要结构，并具有局部侵袭性，导致难以实现活检和/或手术切除。不幸的是，化学治疗DMGs的疗效有限，标准的辅助治疗是局灶性照射，其中位生存期小于12个月。幸运的是，最近的临床试验已经显示了延长生存期的、有希望的结果。

目前的标准治疗疾病监测方法利用影像学检查（如MRI）来确定肿瘤是否对治疗产生反应。然而，MRI检查费用昂贵，并且在儿童使用时可能需要全麻。研究表明，在不同类型的癌症中，生物液体中生物标志物的水平与疾病负担相关，提示这些生物标志物的连续定量可以帮助监测治疗期间疾病的进展；对生物液体的这种分析通常被称为“液体活检”，并且提供了一个有希望的方法来帮助改善DMG患者的管理。

由于肿瘤的位置和血脑屏障的选择性过滤，H3K27M DMG患者的液体活检的应用是一个独特的挑战。由于脑脊液接近肿瘤组织，它通常比患者血浆具有更高的生物标志物浓度。然而，获取脑脊液比获取血液更具侵入性，特别是在儿童患者中，通常需要进行全身麻醉来进行腰椎穿刺。然而，血浆中DMG衍生的生物标志物的浓度远低于脑脊液。因此，研究人员继续致力于开发更高灵敏度的检测方法，并研究对其他更高浓度的生物标志物的监测，以实现液体活检在DMG管理中的潜在用途。

液体活检标本中儿童脑肿瘤生物标志物的检测

最早的DMG液体活检研究试图检测DIPG患者脑脊液中的肿瘤来源的蛋白。该研究测量了DIPG患者脑脊液的综合蛋白谱，发现了528种独特的蛋白，其中71%是分泌蛋白。在血清和尿液中可检测到CypA水平，可能在肿瘤诊断、亚型诊断和治疗反应中发挥作用。此外，脑脊液中DDAH1表达的患者表现出侵袭性的临床病程，影像学结果与肿瘤快速生长一致。鉴于脑脊液中DDAH1的差异表达，它可能对患者分层和治疗结果评估有预后影响。

表1 H3K27M液体活检检测方法综述

然后，研究转向了检测肿瘤来源的循环肿瘤DNA（ctDNA）。肿瘤的突变谱对于正确诊断和设计靶向临床治疗非常有价值。2017年的一项研究首次报道了在来自DMG儿童的脑脊液样本中的循环肿瘤DNA（ctDNA）中检测到组蛋白H3突变。研究者的两种策略，Sanger测序和巢式PCR，都证明了在脑脊液中检测H3突变的可行性。

2018年的一项研究发现，在从侧脑室获得的患者脑脊液中检测到的H3K27M突变DNA的拷贝数是从腰椎穿刺获得的脑脊液的两倍。DIPG细胞的体外培养显示，随着细胞的增殖，更多的ctDNA被释放到培养基中。当用辐射处理时，总ctDNA和H3K27M拷贝在辐射后72-120小时显著增加，之后数量趋于平稳。这些结果表明，可以使用ddPCR的ctDNA定量来跟踪肿瘤负荷和对治疗的反应。

另一项2018年的研究首次尝试对脑脊液样本进行连续时间点收集和分析，观察使用ddPCR跟踪真实患者的治疗反应是否可行。收集脑脊液的位置影响ctDNA丰度，脑脊液样本收集位置接近肿瘤，较更远的位置产生更多的H3K27M拷贝。在83%的病例（10/12）中，H3K27M ctDNA的下降与肿瘤对放疗的反应相关。

2019年的一项研究探索了在接受放疗的已知阳性患者中检测到H3K27M突变。受试者的血浆100%在放疗后（6/6）、100%在治疗中(7/7)、71%在进展时（5/7），100%在研究终点访问时（5/5）中检测到H3K27M ctDNA。综上所述，这两项研究证明了在疾病监测期间使用ctDNA补充MRI的转化相关性，以及在血浆中使用ctDNA作为诊断和预后工具的可行性。

正在进行的临床试验，利用液体活检进行监测

只有少数临床试验使用液体活检生物标志物来评估预后。然而，在临床试验中更多地使用液体活检生物标志物可以帮助优化液体活检分析，并允许其与评估预后的传统方法进行比较。一项正在进行的临床试验（NCT01106794）结合血浆和脑脊液收集进行分析。有4个CAR-T试验（NCT04196413、NCT04185038、NCT05768880和NCT04099797）正在从Ommaya囊中连续收集脑脊液。

一项正在进行的试验，名为“弥漫性中线胶质瘤的联合治疗”（NCT05009992），正在研究ONC201与panobinostat或paxalisib联合治疗DMG患者是否有效。类似地，另一项正在进行的试验“ONC206治疗新诊断或复发性弥漫性中线胶质瘤和其他复发性恶性中枢神经系统肿瘤”（NCT04732065）正在研究ONC206联合或不联合放疗治疗DMG患者的效果和最佳剂量。最后，纪念斯隆凯特琳癌症中心于2019年获得批准，其内部液体活检测试称为MSK-ACCESS（循环cfDNA分析以评估躯体状态）。结果表明，73%的样本检测到体细胞改变，其中56%有临床可操作的改变，表明血浆中ctDNA作为基因组谱来源的重要性。

目前最先进的水平和未来的方向

H3K27M突变肿瘤液体活检工作正在继续评估ctDNA检测和定量在跟踪疾病和监测治疗反应方面的效用。然而，准确地定量小浓度的ctDNA，仍然在技术上具有挑战性和容易出错。

表2总结了测量生物液体中ctDNA的现有方法及其优缺点，以及对液体活检治疗反应监测的每种方法的建议使用。

表2 ct-DNA液体活检方法及其优缺点，以及在H3K27M改变DMG的液体活检中的应用

无论采用何种检测方法，脑脊液通常都是一种比血浆更好的分析物。Ommaya囊虽然目前还不是治疗DMG的标准措施，但增加使用将提供容易和频繁的脑脊液获取，并比血浆分析具有明显的优势。

尽管如此，血浆通常仍然更容易获取。常规抽血可以送到中央检测设施进行分析，不需要昂贵和损伤性的现场采集。目前液体活检的最佳实践利用ddPCR或错误校正测序技术，如通用分子标识符（UMIs）。与测序相比，ddPCR具有明显的优势，包括更低的成本、增加的周转时间、以及提高的精度/降低扩增偏倚的可能性。

下一代测序（NGS）提供了一种更通用的方法。由于NGS通过杂交捕获使用靶向富集或通过PCR进行靶向扩增，因此进行设计和验证的方法要简单得多，并且可以调查数十万个位点的突变。然而，测序的成本更高，而且通常要慢得多。大面板测序将是最有用的筛查或在拐点期间的肿瘤演变监测，如临床进展。

除了肿瘤DNA外，H3K27M突变型胶质瘤患者的脑脊液和血浆中还存在许多其他肿瘤来源的生物标志物，包括突变或修饰的组蛋白和核小体复合物。与ctDNA跟踪相比，将这些蛋白质与ctDNA一起跟踪可能会提高精度和准确性，需要的患者样本要少得多，并提供了不同于核ctDNA的独特的治疗依赖动力学。

虽然与之前的ctDNA监测技术相比，这些替代生物标志物的检测可能提供更高的灵敏度，但ctDNA标记物检测仍然是监测治疗反应的研究最多和标准方法，在临床中立即有用。这推动了改进的检测方法的发展，即非常敏感、精确和灵活，以监测患者特异性标记物。使用实时纳米孔测序仪的靶向扩增子测序提供了基于ddPCR检测的一个令人兴奋的替代方案，因为它成本低、快速，并允许更容易的个性化检测设计。无论采用何种方法，检测方法都应注重保持合理的成本和最多三天出结果的时间，以提高作为实验室设计的试验或体外诊断试验实施的可能性。

图1聚焦H3K27M的液体活检的过去、现在和未来

结论

鉴于H3K27M突变型DMG肿瘤的解剖位置和侵袭性，液体活检被证明是疾病监测和治疗分层的辅助手段。在短时间内，多种技术已经发展出来，用于使用脑脊液和血浆的临床相关肿瘤液体活检，新技术有望检测具有更高敏感性和特异性的其他肿瘤生物标志物。另一个重要的阻碍是为了广泛用于临床（研究测试之外），而将这些检测移交到CLIA认证。最终，利用连续液体活检标本进行疾病监测的能力可以降低发病率和提高治疗效果，并有可能改善这种致命疾病患者的临床结果。

参考文献：Jina Patel, Rayan Aittaleb, Robert Doherty, Ananya Gera, Benison Lau, Dana Messinger, Jack Wadden, Andrea Franson, Amanda Saratsis, Carl Koschmann, Liquid Biopsy in H3K27M Diffuse Midline Glioma, Neuro-Oncology, 2023; noad229, https://doi.org/10.1093/neuonc/noad229

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撰稿：赵传

审校：张俊平，赵传

排版：张静静