登上Nature，剑桥团队开发新型tRNA展示技术

“分子工厂”（Molecular factories）等技术的进步，加速了合成生物学领域的发展，有潜力促进开发出从药物到洗涤剂和家用塑料等多种新产品。然而，此前，工程微生物的功能受到一定的限制，一个原因在于 DNA 只能重编程产生少数氨基酸。

近日，英国医学研究委员会分子生物学实验室（MRC LMB）提出了一种打破工程微生物进化僵局的方法，即利用生物体基因密码中不存在的化学构件将细菌细胞重编程为合成新物质的“微型工厂。”

在研究中，研究团队开发出了一种新的 tRNA 展示技术（tRNA display），能够直接、快速和可扩展地选择正交合成酶，这些酶可以选择性酰化其与大肠杆菌中非天然单体（Non-canonical monomers，ncM）的同源正交 tRNA ，而与 ncM 是否为核糖体底物无关。基于这些进展，该团队证明了 β-氨基酸和 α,α-二取代氨基酸可通过基因编码、位点特异性整合到蛋白质中，扩大了细胞内合成聚合体和蛋白质的化学范围。

（来源：Nature）

该研究已发表在了Nature上。本文的通讯作者是Jason Chin，他是 MRC LMB 的项目负责人以及系统遗传密码重编程/化学与合成生物学中心的负责人，也是剑桥大学化学与化学生物学教授。其实验室的重点研究方向是开发和应用重编程生物体遗传密码的方法，曾构建出全球首个完全重新编码 DNA 的合成生物体。

“所有天然蛋白质都是由 α-L-氨基酸连接形成的聚合物。该团队的突破是对常见的大肠杆菌肠道微生物进行改造，使其基因产生其他‘非天然’模块，例如β-氨基酸和 β-羟基酸等，从而促进开发出多种新聚合物。”

打破“进化僵局”，扩大遗传密码的化学范围

根据遗传密码扩展和重编程需求，目前设计正交氨酰基-tRNA 合成酶酰化新单体的方法依赖于翻译读出，因此要求单体是核糖体底物。然而，非规范单体是一种较差的核糖体底物，正交合成酶不能进化成与非规范单体酰基化正交的 tRNA，核糖体也不能进化为聚合无法酰化到正交 tRNA 上的非规范单体，这种相互依赖性造成了“进化僵局”。

从本质上讲，这将活细胞中的翻译范围限制为 α-L-氨基酸和相关的羟基酸。主链修饰单体的体内位点特异性插入是将编码细胞聚合物合成范围扩展到 α-L-氨基酸及其类似物之外的一个长期挑战。

本研究中提出的 tRNA 展示技术旨在系统打破迄今为止限制体内特异性酰化正交 tRNA 的单体范围的“进化僵局”。“我们想到是否可以通过开发正交合成酶打破这种僵局，这些合成酶可以利用 ncM 选择性酰化其同源正交 tRNA，与 ncM 是否为核糖体底物无关。”

这项研究建立在研究团队早期研究工作的基础上。此前，该研究团队描述了一种可快速确定细胞内 tRNA 氨酰化状态的方法—— tRNA 延伸（ tRNA Extension，tREX），这一方法可以快速发现和进化正交氨酰-tRNA 合成酶与 tRNA 对。该团队使用 tREX 在大肠杆菌中测试了 243 个候选 tRNA，并鉴定了 71 个正交 tRNA。最终，他们发现了五个正交对，进化出两个新的氨基酸底物特异性，并使用 tREX 表征了 64 种正交合成酶-正交 tRNA 特异性的矩阵。

在最新的研究中，该团队构建出了一种 tREX 衍生物，以此从细胞中分离出的特定酰化 tRNA 能够被荧光标记（fluoro-tREX）或捕获（bio-tREX）。他们开发了一种分解的策略，将马泽甲烷球菌的吡咯赖氨酰-tRNA的反密码子（pyrrolysyl-tRNACUA）分解为 \({{\rm{t}}{\rm{R}}{\rm{N}}{\rm{A}}}^{{\rm{P}}{\rm{y}}{\rm{l}}}\) ，反密码子包含新的 5' 和 3' 端。

通过检测和分离酰化 tRNA，研究人员证明了 Fluor-tREX 方法能够通过生成荧光信号跟踪 tRNA 的酰化状态，且 Fluor-tREX 具有较宽的动态检测范围，可以检测到低活性合成酶变体的状态；同时，研究人员也证实了 bio-tREX 能够从酰化的 tRNA 中选择性捕获 tRNA 延伸产物。

（来源：上述论文）

接下来，研究人员尝试通过分解tRNAPylCUA基因构建分解的tRNAPyl（stRNAPyl），并设计一系列构建体和 stRNA Pyl 的表达系统。结果显示，tRNAPylCUA可以从单个转录物中分裂和表达，并且分裂的 tRNA 是 PylRS 酰化的有效底物。

然后，研究人员进行了针对 PylRS 的酰化特异性富集测试，通过将 stmRNAvol2构建体与 bio-mREX 相结合，开发了一种 Pulldown 选择性分离具有活性 PylRS 变体的 cDNA，并有效区分具有一系列活性的变体。

研究人员还测试了 tRNA 展示方法，发现这种展示方法能够从 PylRS 序列库中直接、独立翻译识别具有活性和选择性的 PylRS 酶。随后，研究团队进一步验证了 tRNA 展示的实用性。

之后，研究团队鉴定了正交合成酶-正交 tRNA 对，用八个非天然氨基酸和八个 ncM 特异性酰化其同源正交 tRNA，包括几个 β-氨基酸、α,α-二取代氨基酸和β-羟基酸。紧接着，研究团队测试了 β-氨基酸、α,α-二取代氨基酸和 β-羟基酸插入蛋白质中的情况。试验结果显示，ncM 一旦酰基化到正交 tRNA 上，就会抑制琥珀密码子（amber codon，一种终止密码子）的读取，发现这些 ncM 特有的正交合成酶为选择核糖体提供了一个起点。

（来源：上述论文）

最后，他们还解析了首个体内合成含有 β-氨基酸结构的蛋白质。通常天然得到的氨基酸大部分是 α-氨基酸，唯一常见天然存在的 β-氨基酸是 β-丙氨酸。

“以上述的发现为基础，我们证明了 β-氨基酸和 α,α-二取代氨基酸可以通过基因编码、位点特异性细胞结合等方式插入到蛋白质中，从而增加了可插入非天然氨基酸的种类，扩大了遗传密码的化学范围。”

已申请技术专利

研究团队的发现为遗传密码修饰添加了新的模块，β-氨基酸、α,α-二取代氨基酸和 β-羟基酸等模块可以促进领域内开发出更多新的聚合物。比方说，广泛使用的材料，如聚氯乙烯、聚四氟乙烯和凯夫拉纤维，以及生物分子和酶。

科学家们还表示，该技术具有长期潜力，可以大规模生产抗生素等药物。根据论文，β-氨基酸和α,α-二取代氨基酸的遗传编码有潜力在活细胞中产生蛋白酶抗性蛋白质和新的药物样分子，也有潜力编码完全由 β-氨基酸和其他 ncM 组成的非天然折叠体的生物合成，从而补充和增强生物体的功能。

根据《金融时报》的报道，该研究团队已经根据最新的工作提交了专利申请，一旦成功申请，这项专利极大可能会被授权给英国医学研究委员会分子生物学实验室此前成立的衍生公司Constructive Bio继续推进转化工作。

这是一家位于英国的合成生物学初创公司，2022 年基于Jason Chin实验室的研究分拆独立运营，同年完成 1500 万美元的种子轮融资。Jason Chin 领导的科学团队发现了如何在生命密码中添加新的化学字母，基因中的 DNA 可以通过这些字母告诉细胞制造特定的生物分子。

根据官网的介绍，这家公司正在重写细菌的遗传密码，并通过全基因组写入和工程化翻译技术开发“下一代”药物和生物降解塑料等多种工业新材料。Jason Chin目前在该公司担任首席科学官。

素材来源官方媒体/网络新闻

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