上海
撰文丨王聪
编辑丨王多鱼
排版丨水成文
RNA结合蛋白（RBP）与其RNA靶点动态相互作用，在转录、剪接、修饰、定位、翻译和降解等各个方面调节RNA的命运。RBP本身或其与RNA的结合出现功能障碍，可能导致各种缺陷甚至疾病。有效捕捉RBP-RNA相互作用，特别是动态甚至瞬时相互作用的方法，对于更好地理解RBP及其对RNA靶点的功能作用至关重要。
但目前仍缺乏有效方法来捕获RBP与其RNA靶点之间的稳定和瞬时相互作用，特别是当相互作用是动态的，或是样本量有限时。
2024年1月10日，芝加哥大学何川教授团队在Nature Methods期刊发表了题为：Profiling of RNA-binding protein binding sites by in situ reverse transcription-based sequencing 的研究论文。
该研究开发了一种基于逆转录酶的RBP结合位点测序方法——ARTR-seq，该方法依赖于抗体引导下的RBP结合RNA的原位逆转录来识别RBP结合位点。 ARTR-seq避免了紫外交联和免疫沉淀，从而能够从20个细胞或一个组织切片中高效和特异地识别RBP结合位点。利用快速甲醛固定，ARTR-seq可以在短时间内（10分钟）捕获RBP的动态RNA结合。
广泛使用的识别RBP的靶点的方法是基于特定RBP及其结合RNA的免疫沉淀（IP），通过直接RNA免疫沉淀（RIP）或共价捕获辅助的交联沉淀（CLIP）， 通过RIP或CLIP使用靶向RBP的抗体来富集与特定RBP结合的底物RNA，然后进行高通量测序来描绘整个转录组中的RBP靶点。CLIP-seq通过共价交联捕获底物RNA上的RBP结合位点。RNase处理消化RNA的无RBP区域，提高了结合位点检测的分辨率。CLIP-seq变体如PAR-CLIP或eCLIP提高了交联效率、特异性或结合位点分辨率。
虽然这些方法有效且广泛使用，但也有局限性。由于免疫沉淀效率低，它们通常需要大量的起始材料，基于CLIP的方法中的紫外线交联是一种低效率的化学反应。最近报道的tRIP-seq和LACE-seq可以应用于低输入样本，但以降低文库复杂度为代价。
TRIBE和STAMP方法将RBP与RNA碱基编辑器融合，在RBP结合位点附近引入突变，绕过免疫沉淀来识别RBP结合位点。这些方法可以轻松应用于活细胞中研究RBP结合，并以有限的材料达到单细胞水平，然而，这些基于碱基编辑的方法仍然存在局限性。它们需要在生殖细胞系或细胞系中插入碱基编辑蛋白，从而进行基因组操作，阻碍了它们在原代细胞和组织中的应用。诱导编辑蛋白的表达通常需要大约24小时或更长时间，无法用于监测RBP与RNA的动态结合。此外，这些碱基编辑器有自己的序列偏好，可能会改变目标RBP的天然结合谱。
近期还有研究团队开发了基于CUT&Tag策略的新方法——RT&Tag，这种方法可以识别聚腺苷酸RNA中的RBP结合，但对非聚腺苷酸RNA和胞质RBP结合无效。而且由于其使用的Tn5酶在异源双链上的效率较低，需要25000-100000个细胞核才能获得足够的转录组范围的结合信号。
在这项研究中，何川团队为了克服现有方法的局限性，提出了一种基于逆转录酶（RT）的RBP结合位点测序方法——ARTR-seq，通过原位逆转录酶捕获RBP-RNA相互作用。
实验结果显示，ARTR-seq可以灵敏描绘RBP靶点，测序质量良好，使用仅20个细胞或单个组织切片即可。此外，ARTR-seq程序中可以轻松添加成像步骤，提供RBP的直接空间信息。通过ARTR-seq，研究团队展示了剪接因子和RNA m 6 A修饰的YTH家族阅读器蛋白的独特结合模式。ARTR-seq无偏倚地检测了细胞质和细胞核中RBP与RNA的结合，并测量了RBP在RNA底物上的结合强度。此外，ARTR-seq可以在10分钟的时间尺度上监测G3BP1在应激颗粒（SG）组装过程中的动态RNA结合。
ARTR-seq策略和验证
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41592-023-02146-w
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