元英进院士团队新作：通过酶工程让氯酶具有氟酶活性

有机氟化合物在农业、化工、材料以及制药等多个领域具有广泛应用，以制药为例，氟的引入可以显著改善药物分子的化学物理性质，比如提高稳定性、增强亲脂性以及改善药物与靶点的相互作用等。

虽然如今在有机合成中引入氟的方法已经得到了较好的发展，但是自然界中氟的生物合成却相对罕见，伴随着合成生物学技术的发展，更绿色和更可持续的氟化方法变得可行，因此开发有机氟化合物的生物合成途径是一种较有前景的方法。

氟酶（Fluorinase，FIA）是一种独特的能将氟结合到有机分子中的酶，氟酶代表了将无机氟生物转化为有机氟化合物的一条自然途径，由于在生物合成有机氟化合物方面具有巨大潜力，氟酶已经成为当前合成生物学和生物工程领域的研究热点之一。

近日，天津大学合成生物学前沿科学中心元英进院士团队通过酶工程设计和改造氯酶以获得氟酶的功能，不仅使氯酶具有了氟酶的活性，还揭示了氟与氯之间的酶选择性。目前，这项研究成果已经以“Enzyme Engineering Renders Chlorinase the Activity of Fluorinase”为题发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry上。

（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）

据了解，氟酶最初在卡特利链霉菌中发现，该酶具有将无机氟转化为有机氟化合物的催化能力，是目前在自然界中发现的唯一能催化无机氟形成 C−F 键的酶，其利用 S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）和氟化物通过双分子亲核取代反应（SN2）亲核攻击机制产生 5'-氟-5-脱氧腺苷（5'-FDA）和 L-甲硫氨酸（L-Met）。

现阶段的很多研究大多集中在工程化氟酶方面，虽然氟酶的晶体结构问题已经得到解决，但其中氟化物的缺乏阻碍了详细氟化机制的阐明，从而阻碍了氟酶的工程化，因此还需要开发具有氟化功能的新型酶。

截至目前，研究人员已在自然界中发现了许多卤化酶，它们通过不同的催化机制参与多种重要的天然产物的合成。值得注意的是，在所有卤化酶中，氯酶（SalL）与氟酶（FlA）具有较高的序列同源性（约 35%），并具有类似于氟酶的亲核反应机制，氯酶能够以氯（而不是氟）作为底物，从 S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）生成 5'-氯脱氧腺苷（5'-ClDA）。因此，识别导致卤化物离子具有这种选择性的特征是研究的关键所在。

▲图｜氯酶与氟酶的序列和结构分析（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）

在这项研究中，团队通过将酶工程应用于氯酶，他们发现氯酶的一种突变体 Y70A 获得了氟化活性，丙氨酸扫描发现残基 Tyr70 在这一转化过程中发挥关键作用。

随后，通过对残基 Tyr70 进行位点饱和诱变试验发现，除了 Y70A，氯酶突变体 Y70C/S/T/G 等均表现出了明显的氟化活性，与此同时，与 Y70T 单突变体相比，双突变体 Y70T/W129F 的活性最高，使 5'-氟-5-脱氧腺苷（5'-FDA）的产量增加了 76%。

值得注意的是，氯酶的 G131S 突变体没有表现出氟化活性，该突变体引入了先前曾认为对氟酶中与氟结合至关重要的残基 Ser158。

▲图｜通过量子力学/分子力学计算分析氯酶野生型和突变体的卤化物离子的亲电攻击距离和活化能势垒（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）

最后，基于量子力学（QM）/分子力学（MM）的计算分析显示，与氯酶野生型相比，突变体从氟离子到 SAM 的低能垒和较短的亲核距离可能是其活性的原因所在。

该论文指出，虽然这些突变体的催化效率不如氟酶，但这项研究揭示了卤化酶在亲核卤化过程中对氟或氯的选择性的分子机制，而这在未来拓展有机氟化合物的生物合成途径方面具有潜在的应用价值。

▲图｜天津大学化工学院肖文海、董敏（来源：天津大学化工学院）

该论文共同通讯作者肖文海是天津大学化工学院副教授，他的研究方向主要围绕复杂结构药物、高附加值化学品的高效微生物制造，人工细胞工厂设计与构建，以及发酵过程设计与优化；共同通讯作者董敏是天津大学化工学院教授、博士生导师，他的研究方向为金属酶催化的自由基反应的发现、机制研究和功能改造，辅酶因子 SAM 相关的化学生物学和合成生物学研究，以及基于酶机制的抑制剂设计和药物研发等。

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