海南
分子筛排阻层析(凝胶过滤)是一种根据生物分子的大小及形状来分离物质的层析方法,凝胶过滤介质为多孔的网状结构,样品流经填料时,各组分之间存在分子量的差异,较大的分子率先从层析柱中流出,而分子量越小的生物分子进入介质内部越深,故在介质中的停留时间越长。
1.凝胶过滤层析的特点
·非吸附层析,分辨率与实验条件无关
·操作简便,仅需一种缓冲液
2.博格隆凝胶过滤层析填料的类别及各自特性
(1)博格隆Bestdex系列:葡聚糖凝胶
·Bestdex G系列,数字越小交联度越大,形成的平均孔径越小,分离范围也会越小,常用于蛋白质、多糖、核酸等生物样品的脱盐与缓冲液的置换,也可用于多肽、寡核苷酸、天然产物、化学药物的分离纯化。
·Bestdex LH-20是在BestdexG-25F的基础上用羟丙基修饰而成的,引入羟丙基后使得该介质同时具备亲水性和亲脂性,可以使用有机溶剂作为流动相,适合于天然产物的分离纯化以及化学药物的精细纯化。
(2)博格隆Bestarose系列:琼脂糖凝胶
·Bestorse 4B/6B分别为4%和6%的琼脂糖经乳化、漂洗、分筛而成的凝胶过滤介质,非特异性吸附性低,基质软,具有宽阔的分离范围,适合分离分子量大小差异大并对分辨率要求不高的样品,适用于多糖、核酸、病毒等生物大分子的分离纯化或检测。
·BestorseCL-4B/CL-6B是在Bestarose 4B/ 6B的基础上用双功能交联剂2,3-二溴丙醇交联而成的,分离范围相同,物理化学性能比Bestarose 4B/ 6B有了明显的提高,适合含有机溶剂的分离,可以耐受较强的在位清洗及121℃高压灭菌。
·Bestorse FF也是在Bestarose 4B/ 6B的凝胶基础上用双功能交联剂交联而成的,交联程度比Bestarose CL-4B/ CL-6B高,物理化学性能更稳定,该类介质可以耐受121°C高压灭菌,流速快,适合在大规模分离纯化中应用。
(3)博格隆Chromdex系列:以高交联度琼脂糖为骨架,交联葡聚糖为填充
粒径为34μm,是分辨率与选择性最高的凝胶过滤填料,硬度大,流速快,物理化学性质稳定,非特异性吸附低,是精细纯化阶段的良好选择。
3.凝胶过滤层析填料的应用范围
(1)组分离
大分子样品与离子之间的分离,上样体积可以达到柱体积的30%,可用于脱盐与置换缓冲液。
(2)精细分离
分析纯化:分析纯化的样品应达到分析纯度,用量少,层析柱柱高在15~30cm比较适宜,上样体积在柱体积的0.3%~0.5%之间,确保高分辨率的同时节省实验时间与缓冲液。
制备样品:应用于去除聚集体、分离不同大小分子量的蛋白,柱高应高于60 cm,上样体积在柱体积的0.5%~4%之间。
(3)分子量的测定
利用标准蛋白确定相对分子量与其在凝胶过滤层析介质中的保留时间之间的关系,测定未知分子的相对分子质量。
因为每种介质的孔径都有一定的范围,选择凝胶过滤介质的关键在于选择合适的分离范围,当分子量处于填料的分离区间内且组分分子量相差一倍以上时可保证良好的分离效果。
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