超越CRSIPR，线粒体靶向的ARCUS核酸酶，消除线粒体致病基因突变

本文来自微信公众号：生物世界（ID：ibioworld），作者：王聪

从 1968 年第一个 限制性内切酶 的发现、到 1985 年 聚合酶链式反应 （PCR）技术的发明，再到 2013 年 CRISPR-Cas9 基因编辑 技术的应用，生物技术的每一个突破性发现都进一步提高了我们操纵 DNA，乃至调控生命蓝图的能力。

线粒体 （mitochondrion）是细胞的“能量工厂”，线粒体内有一套独立于细胞核的遗传物质—— 线粒体DNA （mtDNA），人类线粒体 DNA 的长度为 16569bp，拥有 37 个基因，编码 13 种蛋白，这些蛋白都参与细胞的能量代谢。由于线粒体在能量稳态中的重要作用，线粒体 DNA 中 的 点突变 就可导致发育障碍、神经肌肉疾病、癌症进展等等多种严重疾病， 大约 5000 人中就有 1 人患线粒体疾病。

基因编辑技术在细胞核基因组的编辑中取得了辉煌的成绩，但是在线粒体基因组编辑中却滞后很多。开发针对线粒体 DNA 的基因编辑工具一直是线粒体遗传学领域的长期目标，也是研究和治疗线粒体疾病的有力工具。

2023 年 11 月 30 日，迈阿密大学米勒医学院和 Precision 公司的研究人员在 Nature 子刊 Nature Metabolism 上发表了题为：Efficient elimination of MELAS-associated m.3243G mutant mitochondrial DNA by an engineered mitoARCUS nuclease 的研究论文。

该研究开发了一种线粒体靶向的 ARCUS 核酸酶—— mitoARCUS ，该核酸酶被设计用于特异性靶向和切割 线粒体 DNA （mtDNA）的致病性 m.3243G 点突变 。

在含有 95% 突变 m.3243G 的线粒体 DNA 的细胞中，mitoARCUS 可以消除所有含有突变的线粒体 DNA，而不影响正常线粒体。这些正常线粒体 DNA 随后能够被细胞快速复制，以保持线粒体 DN A 拷贝数 的稳 定。通过消除突变线粒体 DNA 并允许正常线粒体 DNA 的重新复制，mitoARCUS 驱动了突变线粒体向健康线粒体的转变，这一过程被称为 异质性转换 （shifting heteroplasmy）。

该研究还通过 AAV 递送 mitoARCUS 的系统给药，证明了 mitoARCUS 在体内编辑线粒体 DNA 的有效性。这些实验数据支持了 mitoARCUS 作为 m.3243A>G 相关线粒体疾病的体内基因编辑疗法的开发。

论文通讯作者、迈阿密大学米勒医学院的 Carlos Moraes 教授表示，迄今为止，线粒体疾病没有治愈性的治疗方法，基因编辑技术作为一种新方法，为线粒体疾病患者带来希望。 然而，许多基因编辑技术，特别是基于 CRISPR 的基因编辑技术，由于其复杂的多组件，一直无法有效地靶向突变的线粒体 DNA，因此它们被认为不是线粒体疾病的有效治疗选择。 mitoARCUS 的简单性使其成为第一种不仅能够区分 m.3243A>G 点突变，还能有效地消除这一点突变的方法，能够使正常的线粒体 DNA 在细胞内重新复制并恢复功能。这一令人兴奋的进展有望为患有 m.3243 突变相关原发性线粒体疾病的患者带来治愈性治疗方法，并且 ARCUS 技术将来还可能被应用于研究和治疗其他线粒体疾病。

线粒体脑肌病伴高乳酸血症和脑卒中样发作 （mitochondrial encephalopathy,lactic acidosis,and stroke-like episodes），简称 MELAS 综合征 ， 是一种多系统线粒体疾病，也是最常见的线粒体脑肌病。其具体症状因人而异，但通常包括反复卒中样发作、脑病和乳酸积累。完全症状患者出现神经系统症状后的中位生存时间约为 17 年，平均死亡年龄为 34.5±19 岁，目前尚无治愈这种疾病的方法。

MELAS 综合征涉及多个 线粒体 DNA （mtDNA）基因突变，包括 MT-TL1、MT-TK、MT-TQ 和 MT-ND5 等，其中最常见的突变位点是在编码线粒体 tRNALeu(UUR)的 MT-TL1 基因中。特别是，mtDNA 的 3243 位点的 A>G 点突变（m.3243A>G）导致了>80% 的 MELAS 综合征。此外，除了 MELAS 综合征，m.3243A>G 突变还与多种其他临床表型相关，包括听力丧失、偏头痛、肌肉无力和糖尿病等，总体而言， m.3243A>G 突变的人群患病率估计高达 1/400。

ARCUS 是由 Precision 公司的科学家发现和开发的专有基因组编辑技术。它使用序列特异性的核酸酶来切割 DNA，能够在细胞和生物体体内实现对 DNA 的敲除和敲入。ARCUS 基于一种天然产生的基因组编辑酶 I-CreI 重新设计改造而来， I-CreI 是在莱茵衣藻中进化，可在细胞 DNA 中进行高度特异性切割，并通过同源重组实现在切割位点的基因敲入。

此前，Precision 公司已经将不同 的 ARCUS 核酸酶 应用在了 敲除胆固醇代谢基因、转甲状腺素蛋白淀粉样纤维生成基因、灭活乙肝病毒，以及构建同种异体 CAR-T 细胞等领域。

2021 年，他们发现了一种线粒体靶向的 ARCUS 核酸酶—— mitoARCUS ，可以通过腺相关病毒 9 型（AAV9）进行系统性递送，在小鼠体内消除线粒体 DNA 的 m.5024C>T 点突变【2】。

对于线粒体 DNA 的基因编辑而言，ARCUS 相比 ZFN、TALEN 以及基于 CRISPR 的可编程基因编辑技术具有几点优势：ARCUS 是一种单组分蛋白质，可以同时识别 DNA 和产生 DNA 双链断裂（DSB），其大小仅为约 1100bp，可使用单个 AAV 载体递送，而且，可以对其优化底物识别相关氨基酸，以提高活性和特异性，从而产生高度特异性的 ARCUS 核酸酶。

基于 ARCUS 的这些特点，以及线粒体 DNA 中 m.3243G 点突变的流行，研究团队开发并优化了一种能够特异性识别和切割线粒体 DNA 的 m.3243G 点突变的 mitoARCUS 核酸酶。

▲图｜添加了线粒体靶向序列（MTS）的 mitoARCUS，可定位到线粒体

实验结果显示，mitoARCUS 核酸酶具有高度特异性，能够高效切割携带 m.3243G 点突变的线粒体 DNA，从而通过 异质性转换 （shifting heteroplasmy），驱动正常线粒体 DNA 的复制，恢复线粒体功能。这一过程没有任何因消除突变线粒体 DNA 产生的瞬时线粒体 DNA 耗竭相关毒性。

此外，研究团队还 mitoARCUS 核酸酶的细胞核基因脱靶编辑进行了表征，并确定除了添加线粒体靶向序列（MTS）外，还可以通过添加出核序列（NES）进一步保护细胞核基因组。

最后，研究团队开发了携带线粒体 DNA 的 m.3243G 点突变的新型小鼠模型，并通过 AAV 递送 mitoARCUS 的系统给药，证明了 mitoARCUS 在体内编辑线粒体 DNA 的有效性。这些实验数据支持了 mitoARCUS 作为 m.3243A>G 相关线粒体疾病的体内基因编辑疗法的开发。

Precision 公司首席研究官 Jeff Smith 博士表示，对于线粒体疾病，ARCUS 之所以成为如此优雅和简单的工具，是因为它是一个单组分蛋白质，可以识别和消除突变的线粒体 DNA。这项新发表的论文进一步验证了 ARCUS 克服基于 CRISPR 的基因编辑技术的限制的能力，用于治疗线粒体疾病，并以高特异性消除突变的线粒体 DNA，以改善整体线粒体功能。此外，这些数据突出了设计 ARCUS 核酸酶的能力，以区分突变和野生型 DNA 序列之间的单碱基变化，即使在非常高的剂量水平下也是如此。这些数据增强了我们对治疗原发性线粒体肌病的新疗法 PBGENE-PMM 的信心，我们期待在 2025 年将该疗法推进到临床试验阶段。

论文链接：

1.https://www.nature.com/articles/s42255-023-00932-6

2.https://www.nature.com/articles/s41467-021-23561-7

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