《Biomaterials》胶原蛋白水凝胶用于恢复大体积肌肉损失！

开发可扩展的血管化和神经化组织是组织工程构建物成功应用于临床的关键挑战。胶原蛋白水凝胶因其天然的优良生物特性而被广泛用于细胞介导的血管网络形成。然而，填充细胞引起的水凝胶收缩大幅增加限制了其长期使用。以前的研究试图通过浓缩胶原预聚物溶液或合成共价交联胶原水凝胶来缓解这一问题。然而，这些方法只能部分减少水凝胶的收缩，同时阻碍水凝胶内血管的形成。

为了应对这一挑战，来自台湾新竹清华大学材料科学与工程系的chen教授团队探究了胶原蛋白添加支撑物对组织修复的影响。本研究以支撑垫片的形式引入了额外的支撑，以抵消填充细胞的收缩力，防止水凝胶收缩。研究发现，这种方法能促进细胞扩散、抵抗水凝胶收缩、控制水凝胶/组织的几何形状，甚至能在短短一周内促进功能血管工程和宿主神经生长。随后，将这些工程组织植入肌肉缺损部位，可及时与宿主血管吻合，从而增强肌肉生成、增加肌肉神经支配并恢复受伤肌肉的功能。总之，这一创新策略拓展了胶原蛋白水凝胶在制造大型血管化神经组织构建物以修复肌肉体积损失（63%）和恢复肌肉功能方面的适用性。

相关论文《Engineering large and geometrically controlled vascularized nerve tissue in collagen hydrogels to restore large-sized volumetric muscle loss》于2023年11月13日发表于期刊《Biomaterials》上。

结果

01

材料设计

本研究旨在设计和使用一种支撑垫片，以降低细胞填充胶原水凝胶的收缩率并控制其收缩方向。为了证明支撑垫片在防止细胞诱导凝胶收缩方面的重要作用，实验分为三组。每组都显示了不同程度的水凝胶-间隔物相互作用和对皮肤压缩的保护（图1a-c），可按升序描述如下："w/o spacer"（无垫片）组：在这一组中，细胞填充的水凝胶一旦从水凝胶模具中分离出来，就被直接使用。因此，没有垫片的保护，在日常活动中容易受到小鼠皮肤的挤压。"placed"（放置）组：在该组中，细胞填充的水凝胶从模具中分离出来，小心翼翼地插入一个间隔物中。垫片的作用是保护水凝胶免受小鼠皮肤在日常活动中产生的挤压力。此外，隔板上的四根支柱还能防止平面内细胞引起的收缩。"in-situ formed"（原位形成）组：水凝胶在间隔物内原位凝胶化，从而在凝胶化过程中水凝胶与间隔物之间产生更强的相互作用。与"放置"组一样，垫片的作用是保护水凝胶免受小鼠皮肤在日常活动中产生的挤压力的影响，另外，四根支柱还能防止平面内细胞引起的收缩。此外，我们还利用间隔物中不同的支柱排列来控制体外和体内细胞填充水凝胶的几何形状，评估它们操纵水凝胶收缩方向的能力。

图1 细胞培养两天后，在三种细胞填充的水凝胶组中，间隔物通过不同的水凝胶-间隔物相互作用控制细胞诱导的水凝胶收缩。细胞填充胶原水凝胶在（a）无细胞组、（b）放置组和（c）原位形成组中的制造过程。图片描述了各组之间的差异，以缩写表示。(d)数码照片显示的是水凝胶在细胞密度为6×106个/毫升的NIH/3T3成纤维细胞的作用下发生收缩的情况。这些照片提供了俯视图（插图）以及具有代表性的荧光显微镜图像，显示了水凝胶中被F-肌动蛋白（Phalloidin，红色）和细胞核（DAPI，蓝色）染色的细胞。(e）对细胞铺展行为和相应的水凝胶收缩进行了定性分析。与无垫片组或放置组相比，未观察到明显差异（ns）。

02

使用支撑垫片可有效防止细胞诱导的水凝胶收缩，同时不影响填充细胞的扩散

细胞诱导的水凝胶收缩会导致纤维密度增加，从而降低水凝胶的透明度，因此可以通过测量水凝胶的不透明度差异来研究胶原蛋白的收缩过程，不透明度差异用二维表面图表示（图2a-b）。为了更好地理解水凝胶的收缩过程，对细胞铺展过程进行了有限元模拟，并进一步表征了细胞诱导的水凝胶收缩（图2c-f）。模拟考虑了水凝胶内填充细胞的收缩力和隔层的阻力，生成了水凝胶的平面内位移轮廓图（图2c和d）和应力分布图（图2e和f）。

图2 细胞培养两天后，三种细胞填充水凝胶组中细胞通过不同的水凝胶-垫片相互作用诱导胶原水凝胶收缩的计算模型。(a)从（图1d）中的插图转换而来的二维彩色图像说明了水凝胶-垫片相互作用如何影响三组细胞填充水凝胶中细胞诱导的水凝胶收缩。(b）研究了被外围支柱包围的水凝胶内部和外部区域的不透明性。COMSOL模拟显示了细胞填充水凝胶从第0天到第2天的平面内（c）位移和（e）应力轮廓。测量了三组水凝胶外部区域随时间变化的平均（d）位移和（f）应力。

03

支撑垫片可有效防止细胞诱导的水凝胶收缩，从而实现大尺寸血管化细胞填充水凝胶的工程设计

为了证明水凝胶与支撑垫片的相互作用对小鼠体内皮下细胞介导的血管化组织形成的重要性，分别将无支撑垫片组、放置组和原位形成组制备的细胞填充胶原水凝胶植入免疫缺陷小鼠体内。观察植入物体积并利用显微CT成像观察三组水凝胶的血管结构和形态。不过，值得注意的是，由于造影剂Micro Fil的限制，无法在体内观察到直径小于20μm的微血管。

图3 使用显微计算机断层扫描（micro-CT）成像技术，显示了由w/ospacer设计的高血管化水凝胶在小鼠皮下植入7天后的放置和原位形成情况。(a-c）俯视图（上排）和侧视图（下排）的高倍显微CT图像显示，HUVECs和间充质干细胞以10×106/mL的密度填充水凝胶（黄色断线）。Micro Fil标有星号*。整个水凝胶的宏观图见（a-c）左上角。(左下角）水凝胶（蓝色）内Micro Fil灌注的血管网络（粉红色）的代表性micro-CT2D图像由黄色断线表示。在组织脱水前对(d)水凝胶总体积、(e)血管网络生长高度和(f)细胞填充水凝胶中灌注血管的直径进行了量化。

从H&E组织学切片（图4a）来看，间隔物的存在并不影响胶原水凝胶中植入人体细胞的血管生成、宿主血管的血管生成以及人体细胞与宿主血管的吻合。

图4.细胞填充水凝胶植入小鼠皮下7天后，三组水凝胶中形成的灌注血管。(a)H&E染色的整个水凝胶水平切片和部分放大区域（插图）。工程细胞填充的水凝胶用黑色断线标记。黄色圆点和黄色箭头指向含有红细胞的血管腔。(b）在水凝胶内观察到人类血管（hCD31阳性，棕色，黑色填充箭头）和宿主小鼠血管（hCD31阴性，透明填充箭头）。对水凝胶内的(c)血管总数、(d)人类管腔数量和(e)人类（hCD31阳性）血管百分比进行了定量分析。(ns表示与不含垫片组或放置垫片组无明显差异）。

这些结果表明，添加间隔物并在其内部进行原位胶凝，可以有效地保持细胞填充水凝胶的体积，防止来自小鼠皮肤的平面外压缩力，并阻碍平面内细胞引起的水凝胶收缩。这可以通过使用外支柱和增加水凝胶与间隔物之间的粘附力来实现。

04

血管化细胞填充水凝胶中的灌注血管支持宿主神经元的生长

在三组水凝胶中均观察到hCD31阳性微血管（图5a和d中为绿色）周围有表达α-SMA的间充质干细胞（图5a中为红色）作为周细胞。在所有三组中，约70-80%的血管被周细胞（αSMA+）覆盖（图5d），这表明在胶原水凝胶中使用HUVECs和间充质干细胞可在一周内导致体内成熟血管网络的形成。这些结果表明，在间充质干细胞与HUVECs的共培养条件下，成熟的血管网络得以形成。

图5 第7天在小鼠皮下形成的三组细胞填充水凝胶中生长的血管和神经元之间的相互作用。具有代表性的免疫荧光图像显示(a)成熟血管（黄色箭头）由hCD31阳性内皮细胞（绿色）组成，周围环绕着αSMA（红色）。(b)位于hCD31阳性血管（血管，绿色）附近的神经丝（NF）阳性神经元（N，红色）。(c）β-III管蛋白和NF阳性神经元的体节（白色箭头）和轴突（粉红色小箭头）。定量分析包括（d）αSMA+细胞在hCD31+血管上的覆盖率，（e）在距血管50μm范围内发现的NF+细胞的百分比，以及（f）400倍放大镜下每个视野中NF+/β管蛋白+细胞的数量。数据以平均值±SD表示（n=3-5）。#ns表示与无垫片组或垫片组无显著差异。

05

间隔物上支柱的排列可在体外和体内控制细胞填充水凝胶的几何形状

每个损伤缺损都有其不规则的形状和大小，因此探索创建不同形状的血管化组织非常重要。为了研究间隔物上支柱的排列是否能控制收缩胶原水凝胶的平面内几何形状，我们在放置组中使用了外支柱排列成三角形、方形和圆形的间隔物来制备水凝胶。结果表明，垫片上不同排列方式的支柱并不妨碍组织构建物内部微血管的均匀形成，而且可在一周内用于操控各种几何形状的血管化组织形成。平面内收缩位移可以通过调整隔板上支柱的排列来操控。通过合理设计支柱在间隔物上的位置，可以成功创建具有不同程度对称形状的组织结构。

图6 通过控制间隔物上三角形、方形和圆形支柱的排列，在体外和体内对细胞填充的水凝胶进行几何控制。(a）经过2天的三维细胞培养后，显示了放置组中细胞填充水凝胶（插图）的代表性俯视照片。显示了水凝胶内细胞的相应共聚焦荧光图像，F-肌动蛋白染成红色，细胞核用DAPI染成蓝色。(b)细胞填充水凝胶内的细胞扩散面积（投影细胞面积）和增殖率。(c）小鼠皮下细胞填充水凝胶的宏观照片，黄色虚线表示相关区域（插图）。使用H&E染色的水平切片对组织构建体进行进一步分析。水凝胶中含有红细胞的血管腔以黄点标出，并用黑色断线标出。(d）水凝胶中的血管总数。数据以平均值±SD表示（每组n=4-5）。(e）COMSOL模拟显示的平面内位移等高线；（f）细胞填充水凝胶的平均收缩位移。

06

较大的支撑垫片成功实现了具有均匀分布的微血管和神经细胞的较大尺寸细胞填充水凝胶的工程设计

为了工程化大尺寸血管组织，制备了直径为20毫米的原位细胞填充水凝胶，并将其植入小鼠皮下。结果表明HUVECs和间充质干细胞之间发生了血管生成，在水凝胶内部形成了管腔网络，而新的小鼠血管则从现有的血管中萌发生长，与这些人类管腔吻合，向水凝胶边缘区域灌注血液。这种灌注过程提供了必要的营养物质，并支持血管生成过程从周围区域逐渐向水凝胶中心区域发展，从而降低了水凝胶中心区域的密度。此外，扩大所设计的间隔物的直径可以成功地在原位形成具有均匀分布的灌注微血管和运动神经元的更大细胞填充胶原水凝胶。

图7 在皮下植入7天后，直径为20毫米的较大间隔物有助于工程化大尺寸细胞填充水凝胶，其中含有均匀分布的微血管和神经细胞。(a)Micro Fil灌注的血管网络的代表性micro-CT2D图像，可从俯视图（上排）和侧视图（下排）观察到工程组织结构（黄线断开处）。灌注的血管用粉红色标记，胶原水凝胶用蓝色标记。整个水凝胶的宏观视图显示在左上角。左下角部分放大的高倍显微CT图像显示灌注血管网络的形态。(b)H&E图像显示大面积细胞填充的水凝胶，血管分布均匀。黄色圆点和箭头指向含有红细胞的血管腔。(c）免疫组化hCD31染色图像显示存在人体血管（hCD31阳性，棕色）。黄色圆点表示含有红细胞的人体血管。(d)hCD31阳性血管（血管，绿色）附近的神经丝蛋白（NF）阳性神经元（N，红色），以及(e)β-III管蛋白和NF阳性神经元的体节（白色箭头）和轴突（粉红色小箭头）。(f)水平切片和(g)垂直切片中总血管、人血管和小鼠血管的分布。

07

原位形成组制备的预血管化神经组织促进了成熟肌纤维的形成

在小鼠左后腿股四头肌上建立直径为4毫米的全厚缺损，经过计算，确定切除肌肉的重量约为原始股四头肌的63±3%，从而证实该缺损为VML缺损。为了研究预血管化神经组织策略是否能促进VML骨骼肌修复，将HUVEC填充组（仅H组）和原位形成组制备的水凝胶构建体植入肌肉缺损部位。与纯H组（不含血管和神经的水凝胶构建物）相比，原位形成组（包括预成血管和神经的水凝胶构建物）能有效促进肌肉修复，并抑制VML损伤部位结缔组织的形成。这些结果凸显了预血管化神经组织在修复大面积VML损伤中的重要作用。

图8 植入小鼠骨骼肌8周后，原位成形组促进了受损骨骼肌的修复。(a)展示了修复后缺损部位的俯视图（上排）和侧视图（下排）。黄色断线突出显示了修复后的组织。(b-c）未经处理的空组、纯凝胶组和原位成形组（b）侧视图和（c）正视图的代表性马森三色染色图像，"M"表示肌肉，"C"表示结缔组织。(d)不同组前视图中VML缺陷修复肌肉的代表性层粘连蛋白（红）/MF20（绿）/细胞核（蓝）染色图像。比例尺：25μm。(e)损伤部位侧视切片中结缔组织（蓝色）和肌肉组织（红色）的总修复面积和修复比例量化。(未受伤组设定为100%）。(f）修复肌肉区域的肌纤维束面积（%）、（g）密度和（h）单个肌纤维的面积。

08

原位形成组制备的预血管化神经组织可促进神经肌肉再生

对修复组织构建体的侧视切片进行免疫荧光染色来确定损伤部位是否存在运动神经元。以及运动功能测试，即斜杆测试，在植入后4周和8周进行，以研究观察到的神经元的神经支配及其对肌肉修复的影响。结果表明，原位成形组形成的预血管化神经组织加速了VML损伤部位的肌肉成熟和运动恢复，从而改善了运动功能。

图9 植入8周后，在皮下间隙预先形成的原位组促进了小鼠运动功能的恢复。(a)移植后第1、2和8周，未经处理的空组、纯H组和原位形成组的侧视切片中神经支配（β-Tubulin III，绿色；NF，红色；Dapi，蓝色）的代表性免疫荧光染色。白色箭头表示β-Tubulin III和NF双阳性神经元。(b）在400倍放大镜下，对修复肌肉区域的β-Tubulin III和NF双阳性神经元进行定量分析。**p<0.01表示与空白组相比差异显著。#p<0.05和##p<0.01表示与纯H组相比差异显著。与健康组相比，@@p<0.01。(c-d）倾斜平面测试（30-60°）用于评估运动功能恢复情况。(c）有效测试和（d）不同组别的跳跃率（n=6）。

09

在损伤部位与宿主微血管快速吻合以改善肌肉修复

为了进一步研究肌肉修复过程中预成血管网络与宿主血管之间的血管吻合情况，对植入缺损部位的纯H组和原位成形组进行了显微CT成像（图10a）和组织学分析（图10b和c）。结果表明，我们在损伤部位预制的人体血管网络在植入后成功地与宿主血管连接并实现血管再通。随着时间的推移，它们逐渐被宿主血管取代，促进了运动神经元的生长并支持了血管重塑。

图10 细胞填充水凝胶中预先形成的血管网络与宿主血管之间的吻合改善了小鼠的肌肉修复。(a）血管网络的显微CT图像；（b）植入后2周和8周在损伤部位拍摄的Micro Fil灌注细胞填充水凝胶（黄线断开处）的代表性H&E图像。灌注的血管用黄色箭头标记，血管中的黑色颗粒是富含铅的血管收缩剂Micro Fil。(c）在修复的损伤部位观察到人血管（hCD31阳性，棕色，棕色填充箭头）和宿主小鼠血管（hCD31阴性，透明填充箭头）。定量分析（d）总血管密度、（e）人血管密度和（f）组织构建物内人（hCD31阳性）血管的百分比随时间的变化，揭示了肌肉修复过程中血管吻合和血管重塑的进展。

长期以来，血管化一直被认为是组织工程中的主要挑战之一，因为它直接影响到工程构建物的可扩展性。细胞诱导收缩是胶原水凝胶的固有特性，限制了其在组织修复细胞输送系统中的应用。在生物工程组织构建物中设计复杂且功能齐全的血管网络对其植入后的存活至关重要。为实现这一目标，人们开发了各种模式化技术，如三维打印、光刻和铸造，以有效地设计血管样结构。然而，植入组织的预血管化所需时间较长，导致移植后存活率显著下降，组织深层的缺陷和缺氧增加。此外，组织的厚度往往无法满足临床要求。

目前的研究表明，使用支撑垫片可在一周内通过控制收缩方向和程度，在体内细胞填充的胶原水凝胶中简单有效地设计出可扩展的、几何形状可控的血管化神经组织。值得注意的是，用这种工程化的细胞填充水凝胶治疗VML缺陷可加速肌肉生成，增加肌肉神经支配，并通过及时的血管生成和吻合来促进神经支配，从而恢复损伤肌肉的功能。总之，该垫片拓宽了细胞填充胶原水凝胶在大型动物模型中的潜在应用，并支持形成可植入的血管和神经，以修复和恢复大体积肌肉缺损的肌肉功能。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2023.122402