FSHW | 自诱导动态调控异源蛋白表达：群体感应系统的构建及优化

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Introduction

酶在食品、农业、饲料和医药等领域具有重要的应用价值，目前，通过微生物异源表达制备是获取酶的重要手段之一。但是在异源表达的过程中，酶的积累会对微生物的生长产生竞争性抑制，为了解决这一问题，常使用诱导型启动子和诱导剂对异源蛋白的表达时间和表达量进行控制。但是诱导剂具有一定的毒性且价格昂贵，不适用于工业化生产。

群体感应(Quorum Sensing, QS)是自然界中存在的一种细菌之间的通讯系统，能够感知细胞密度的变化、自诱导动态调控相关基因的表达。群体感应系统在不同微生物种类中存在形式不同，主要表现在信号分子合成酶、信号分子、信号分子识别受体和启动子的不同。其中，革兰氏阴性菌中的LuxI/LuxR系统研究最为透彻，其原理如图1所示。信号分子合成酶LuxI可以合成酰基高丝氨酸内酯（AHLs）作为信号分子，AHLs顺浓度梯度自由进出细菌，当其在胞外积累一定浓度后，AHLs会再次进入细菌内部与LuxR结合形成二聚体，然后与启动子PluxI的lux box区域结合从而调控后续基因的表达。

图1 LuxI/LuxR群体感应原理

群体感应系统动态调控范围受限，且目前对于群体感应系统的改造主要集中在改造信号分子识别蛋白，提高表达强度。本研究聚焦于不同诱导时间和诱导表达强度，借助启动子工程改造启动子PluxI，提高群体感应系统在酶表达中的应用范围。

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Results and discussion

luxIR上游启动子对启动强度的影响

不同启动子对群体感应系统启动强度的影响如图2所示。当只有PluxI存在时，菌株没有检测到荧光，而当群体感应元件PluxI、luxI和luxR都存在时，荧光强度为6 600 au，证明群体感应系统发挥作用需要完整的元件组成，因此在大肠杆菌中构建完整的基于群体感应系统的自诱导动态调控系统（SIDRE）。将原始启动子PluxI更换为组成型弱启动子PBB控制表达的菌株荧光强度为9 300 au，是原始菌株的1.41倍，组成型强启动子PJ23100控制表达的菌株荧光强度为38 000 au，是原始菌株的5.76倍，说明了luxIR表达水平越高越有利于自诱导表达体系调控目的蛋白的表达。PJ23100也被作为后续实验的最佳调控启动子。

图2不同启动子调控luxIR对群体感应系统的影响

通过启动子工程对启动子PluxI进行改造

为了满足表达不同蛋白的需求，对目的基因上游的启动子PluxI进行改造和不同性状筛选，性状特征主要关注启动强度和启动时间，通过筛选和测序，获得了13个单突变位点菌株和5个多突变位点菌株。对上述的突变菌株进行表征，结果表明多突变位点菌株均没有产生荧光，证明了多位点突变通常是不利突变。在单位点突变的菌株表征中，根据其特征进行划分，结果如图3所示。多数突变体集中在EOF区域，即低荧光强度和低OD600 nm，这部分突变体适用于抑制代谢过程的分支途径；区域AOB中的突变体具有高荧光强度、低OD600 nm和高的单位荧光强度，适合蛋白的表达。各个启动子突变体的具体数据如图4所示。

图3启动子突变体的特征区域划分

图4 启动子突变体的具体数据特征

启动子突变体在蛋白表达中应用

两个具有代表性的启动子PluxI(T-38C)和PluxI(C-77T)被用于进行SIDRE系统的验证，褐藻胶裂解酶AL493和酯酶Est7代替绿色荧光蛋白作为报告蛋白。如图5所示，SIDRE系统调控的菌株生长情况优于诱导型启动子T7调控的菌株。在褐藻胶裂解酶的酶活方面，PluxI(T-38C)调控的菌株表达的酶活为5.091 U/mL，可以达到T7-al493的96.38%。而PluxI(C-77T)调控表达的酯酶Est7最高酶活为3.50 U/mL，为对照组的106.71%。上述实验结果说明了不同蛋白的表达需要不同的启动子进行自诱导。

图5 SIDRE系统调控褐藻胶裂解酶和酯酶的表达

为了使实验结果进一步贴合工业放大生产的要求，SIDRE系统调控的褐藻胶裂解酶AL493进行高密度发酵培养。如图6所示，PluxI(T-38C)调控的菌株最高密度可达到13.23，是对照组的1.46倍，酶活为31.88 U/mL，是对照组的4.34倍。在高密度的发酵体系中，SIDRE系统更适合蛋白的表达。

图6 SIDRE系统和诱导性系统调控下的褐藻胶裂解酶高密度发酵结果

03

Conclusion

在本研究中，作者在大肠杆菌中构建了基于群体感应的自诱导动态调控系统（SIDRE）。通过启动子工程构建了启动子PluxI的突变体库，并进行了筛选和分类。利用该系统对褐藻胶裂解酶AL493和酯酶Est7进行表达，确定最佳启动子分别为PluxI(T-38C)和PluxI(C-77T)，表达效果与诱导型表达系统相当。在高密度发酵中，SIDRE系统表现出了更高的酶活和细胞密度，在酶工业化的生产应用具有潜在价值。

第一作者

曹倬宁，女，现为中国海洋大学食品科学与工程学院博士研究生，主要研究方向为酶自诱导高效表达体系的构建、人乳寡糖的酶法合成。目前发表SCI论文1 篇，授权国家发明专利1 件。

通信作者

刘振，男，中国海洋大学食品科学与工程学院教授，硕士研究生导师。中国海洋大学“青年英才”第一层次、第三届“香江学者”。主持国家重点研发计划政府间国际创新合作重点专项、国家自然科学基金面上项目及多项级省部级项目，在Biotechnology Advances，JAFC，Food Chemistry，Trends in Food Science and Technology等期刊发表论文30余篇，申请专利10余项，参与获得海洋科学技术二等奖1项。研究方向为海洋食品合成生物学，包括海洋生物资源改性修饰与海洋功效因子从头合成。目前聚焦于构建微生物细胞工厂进行红藻、甲壳素等海洋生物资源的高值化利用与海洋萜类的高效合成。

毛相朝，男，现任中国海洋大学食品科学与工程学院副院长、山东省海洋食品生物制造工程研究中心主任。入选国家杰出青年科学基金、国家优秀青年科学基金、国家现代农业产业技术体系岗位科学家和山东省泰山学者青年专家。主要从事海洋水产品生物加工领域的教学与科研工作，主持国家自然科学基金6项、国家重点研发计划课题2项、国家现代农业产业技术体系课题1项以及省部级以上教学改革项目5项。以第一或通讯作者在SCI期刊发表论文80余篇，主编（译）教材著作4部；以第一发明人获授权发明专利50余项，参编行业标准2项。获省部级科技奖励3项、省级教学成果奖3项。荣获第17届中国青年科技奖、第15届霍英东青年教师奖、中国食品科学技术学会杰出青年奖、中国农学会青年科技奖、第22届山东青年五四奖章、第11届山东省优秀科技工作者、山东省优秀研究生导师等荣誉称号。

PluxI mutants with different promoting period and their application for quorum sensing regulated protein expression

Zhuoning Caoa, Zhen Liua,*, Guilin Zhanga, Xiangzhao Maoa,b,*

a College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China

b Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts of Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266237, China

*Corresponding authors.

Abstract

Quorum sensing (QS) system can dynamically control the expression of proteins along with the cell growth. The promoting period of QS system has been little focused on until now. In this study, a self-induced dynamic regulated expression (SIDRE) system was constructed in Escherichia coli. To enable the system suitable for the expression of enzymes, promoter engineering was used to obtain PluxI mutants. To test the SIDRE system, alginate lyase AL493 and esterase Est7 were used as target protein for expression. The enzyme activity of alginate lyase and esterase reached 96.38 % and 106.71 % of the control strains containing the T7 promoter. In high-density fermentation, the activity of alginate lyase expressed by the SIDRE system with PluxI(T-38C) as promoter was 4.34-fold of that expressed by the T7 promoter. Therefore, the PluxI mutants with different promoting periods and/or different strengths show great potential in both laboratory and industrial scale for protein expression.

Reference:

CAO Z N, LIU Z, ZHANG G L, et al. PluxI mutants with different promoting period and their application for quorum sensing regulated protein expression[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1841-1849. DOI:10.1016/ j.fshw.2023.02.048.

文章编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

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