Nature：新型类器官+CRISPR筛选，系统揭示影响神经发育疾病的基因

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

大脑皮层中主要有两种神经元：兴奋性神经元和抑制性神经元。兴奋性神经元发出脉冲激活其他神经元，而抑制性神经元则是阻止其他神经元放电。抑制性和兴奋性神经元整合形成电路，形成大脑的信号活动。

在人类大脑皮层中，多达一半的细胞是抑制性的。科学家们推测，与兴奋性神经元相比，抑制性神经元的数量或功能失衡可能至少部分导致了自闭症和癫痫。如果可以找到改变大脑皮层中这些细胞功能平衡的方法，就有望治疗这些疾病。但首先，我们要如何理解与这些疾病有关的大量基因？它们的影响在很大程度上是未知的。

之前的研究表明，至少有500个基因与神经发育障碍有关，但还不清楚这些基因的缺陷究竟是如何损害大脑功能的。数百种疾病相关基因的存在是否意味着有数百种不同类型的神经发育障碍，每种都需要不同的治疗？或者，几个不同的基因会聚合并导致类似的病理，或者是某个特定的方面？

2023年9月27日，斯坦福大学Sergiu Pasca团队（孟祥玲博士为第一作者）等在Nature期刊发表了题为：Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment 的研究论文。

研究团队将基于iPSC的类器官研究平台构建的“Assembloids”（端脑类组装体）与CRISPR基因筛选相结合，揭示425个神经发育障碍相关基因在抑制性神经元发育中的作用，从中鉴定了13个与抑制性神经元生成有关的基因，例如CSDE1和SMAD4；以及33个与抑制性神经元迁移有关的基因，例如LNPK。

这项研究突出了CRISPR-Assembloids平台系统地将神经发育障碍相关基因映射到人类发育并揭示疾病机制的能力。该研究揭示的数十个基因在神经发育障碍中具有类似的效果，这种通过功能来分类有缺陷的基因的方法可能会加速神经发育障碍的药物开发。

直到最近，还没有办法研究人类大脑的早期发育。在这篇最新论文中，研究团队开创了一项新技术，使对人类大脑发育的详细探索成为可能。他们通过特殊的实验室玻璃器皿，生长因子和营养的组合，以及人诱导多能干细胞（iPSC），产生了一小团神经组织，其解剖结构和功能与人类大脑皮层非常相似，研究团队将其称为皮质类器官（Cortical Organoids）。通过调整培养iPS细胞的营养和生长因子，可以产生类似于另一种大脑结构皮质下结构（subpallium）的类器官，相比于大脑皮层，subpallium位于前脑的更深处，在胎儿和婴儿发育过程中发挥着关键作用：它产生抑制性神经元，即中间神经元，它们迁移到皮层和其他地方，并与兴奋性神经元结合，形成能够产生复杂信号的功能回路。

通过将皮质下结构类器官与皮层类器官相邻放置几天，研究团队第一次观察到了这两种结构是如何融合在一起形成他们所谓的“Assembloids”（端脑类组装体），并观察到抑制性神经元从皮质下结构迁移到皮层，并与那里的兴奋性神经元连接在一起。

在这项新研究中，研究团队将与神经发育障碍相关的661个基因缩小到了425个，这些基因在抑制性神经元中被激活。他们构建了iPS细胞，当分化成多细胞类器官时，这些细胞只在成为抑制性神经元的细胞中发出荧光。通过这种方式，他们可以生成皮质下类器官，这样就可以将抑制性神经元与皮质下产生的所有其他脑细胞类型区分开来。

接下来，研究团队将这项新技术与CRISPR筛选技术结合起来，通过CRISPR筛选，他们从这425个基因中寻找那些被CRISPR破坏后导致抑制性神经元产生缺陷的基因，他们发现了13个这样的基因，例如CSDE1和SMAD4。

为了寻找影响抑制性神经元迁移的基因，研究团队在培养皿中放置了能够产生抑制性神经元的皮质下类器官，旁边是健康的皮层类器官，在每个培养皿中，两种类器官融合形成“Assembloids”（端脑类组装体）。在这些类器官共存大约30天后，研究团队从不同的培养皿中取出了大约1000个端脑类组装体，并在融合点处将它们分开。然后，他们将每个端脑类组装体的皮质下区域的荧光抑制性神经元与那些越过终点线进入该组装体的皮层区的荧光抑制性神经元进行比较。通过基因组测序，他们精确地定位了哪些基因的靶向缺失损害了抑制性神经元的迁移，他们找到了33个这样的基因，例如LNPK。

总的来说，该研究通过iPS细胞构建了“Assembloids”（端脑类组装体），并利用CRISPR筛选技术，鉴定了13个影响抑制性神经元生成的基因和33个影响抑制性神经元迁移的基因。这46个基因已经超过了神经发育障碍相关基因总数的10%，它们组成了一个神经发育障碍的亚组，其特征是对兴奋性皮层神经元的抑制不足。该研究揭示的这数十个基因在神经发育障碍中具有类似的效果，这种通过功能来分类有缺陷的基因的方法可能会加速神经发育障碍的药物开发。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-023-06564-w