Nature Genetics | RNA聚合酶II在增强子-启动子相互作用中发挥关键作用

撰文 | Enigma

许多后生动物的细胞多样性是由被称为增强子的顺式调控元件所编码的，它调节了远端启动子产生mRNA的速率。伴随着40多年前SV40增强子的里程碑式发现，了解增强子和启动子在长DNA序列中交流的分子基础一直是关键的目标。目前流行的模型认为，增强子和启动子在细胞核中形成紧密的物理接近。经典的环模型 (我们统称为结构桥模型) 将这些增强子-启动子相互作用描述为一个物理桥梁，通过这个物理桥梁，增强子和启动子可以通过转录因子、RNA聚合酶II (Pol II) 、介质、内聚蛋白和其他蛋白质和复合物之间高度刻板的蛋白质-蛋白质相互作用连接起来。事实上，基于染色体构象捕获 (3C) 的方法，如原位Hi-C和Micro-C，可以测量在三维空间中紧密相连的DNA序列之间的连接频率，可以用来预测增强子对目标基因的功能影响。此外，增强子-启动子环的变化，包括预先建立的环，与目标启动子的激活有关。

增强子如何在长基因组距离上控制靶基因的表达仍然是一个重要的未解决的问题。然而，尽管有一些证据支持发现最近的一些观察结果与结构桥梁模型不相容。该模型的一个关键原则是，增强子-启动子DNA序列必须足够接近，以便在增强子和启动子之间建立一个连续的蛋白质桥梁。然而，利用显微镜在活细胞和固定细胞中测量几种果蝇和小鼠发育位点的增强子-启动子距离表明，在基因激活时，增强子和启动子平均相距数百纳米。在一个特征明确的位点上，Shh启动子和几个发育增强子之间的物理距离实际上随着基因激活而增加。最后，关于构成物理桥梁的蛋白质 (如介导蛋白和内聚蛋白) 的损耗对3C接触图谱或转录的影响存在相互矛盾的结果。因此，对于以下关于增强子-启动子通讯的长期问题，我们仍然缺乏完整的答案:当增强子激活转录时，增强子-启动子对是否在物理上更接近?这些相互作用是必要的、更持久的或更频繁地建立在从功能上影响其目标启动子表达的增强子上吗?哪些分子在促进促进子-启动子的交流中起作用?

近日，美国康奈尔大学的Charles G. Danko教授在Naturegenetics发表了题为RNA polymerase II dynamics shape enhancer–promoter interactions的研究论文。他们通过整合来自核小体分辨率基因组接触图、新生转录和影响RNA聚合酶II (Pol II) 动力学、数千种候选增强子活性的扰动的数据来研究增强子-启动子之间的通信。通过整合新的Micro-C实验与已发表的CRISPRi数据表明，在功能增强子-启动子对中，与非功能增强子对相比，增强子花更多的时间靠近它们的目标启动子，这可以部分归因于与基因组位置无关的因素。通过对转录周期的操纵，证明了Pol II在增强子-启动子相互作用中的关键作用。值得注意的是，启动子-近端暂停的Pol II本身部分稳定了相互作用。他们提出了一个更新的工作模型，其中转录动力学元素塑造了相互作用的持续时间或频率，并以此促进增强子-启动子的交流。

在本研究中，作者首先在K562细胞中定义了一组功能性增强子-启动子对，使用CRISPRi敲低增强子会影响靶基因的表达，并且在在K562单元中生成了一个约17亿个接触Micro-C数据集。通过进一步对CRISPRi数据分析，发现7个CRISPRi验证的增强子与MYC启动子之间的归一化接触信号显著高于位于相同拓扑相关结构域 (TAD) 内的其他52个TIRs。测试K562细胞中5920个候选增强子的功能，发现功能增强子-启动子对的标准化接触数量显著增加。此外，在相同的超级增强子中，与非功能成分相比，功能成分增强子与目标启动子的接触频率显著更高。即使在排除基因组距离、位点特异性调控效应、染色质可及性和其他混杂因素的影响后，功能活跃的增强子-启动子对的增强子-启动子相互作用频率更高。观察到TSS附近功能增强子-启动子对的富集程度最高，特别是涉及+1和+2核小体的相互作用。功能增强子-启动子对的富集程度随着距离TSS (Pearson’s) 约2.5 kb而衰减。tss功能增强子-启动子对比非功能增强子-启动子对更频繁地存在于非常接近的物理位置。这一结果与增强子-启动子通讯模型一致，包括由转录相关蛋白稳定的增强子-启动子DNA之间非常密切的相互作用。

接下来，作者又研究了哪些细胞因子介导了增强子与其靶启动子之间增加的接触。设计APAs，通过在不同处理条件下，在调整了增强子和启动子锚点附近的局部信号强度后，直接测量接触的变化。使用该策略在阻断Pol II起始 (雷公藤甲素，TRP) 或暂停释放 (黄酮吡醇，FLV) 28后重新分析已发表的Micro-C数据，结果显示，Pol II转录抑制的最大影响发生在TSS附近。Pol II在促进增强子-启动子接触中发挥作用的模型提供了进一步的支持，通过阻断暂停释放，FLV不仅阻止了主动延长的Pol II进入基因体，而且在大多数启动子的TSS附近留下了暂停的Pol II。这些观察结果表明，转录周期的不同步骤可能对增强子-启动子接触产生根本不同的影响，这是基于它们对TSS附近Pol II密度的影响。增强子-启动子的接触依赖于主动转录。紧接着，作者对转录周期中的不同步骤如何与增强子-启动子接触相关进行了探讨。通过使用精确运行和测序 (PRO-seq) 来表征RNA聚合酶的活性，发现增强子-启动子接触与基因体转录水平最相关，增强子-启动子接触的增加也与更高的暂停信号和暂停指数相关。通过分析比较Jurkat T细胞和K562细胞生成的Micro-C数据，发现细胞系之间的转录差异与增强子-启动子接触的差异有关。因此，暂停Pol II对增强剂-启动剂接触有实质性影响，这与起始率或生产延伸率无关。

最后，作者使用小鼠胚胎干细胞 (mESCs) 探究Pol II暂停的影响，其中负延伸因子复合物亚基B (NELFB) 的两个拷贝都被FKBP12F36V标记，允许在dTAG配体存在下快速可逆地降解NELFB复合物。作者根据dTAG冲洗后NELFB耗尽和恢复的时间过程生成了Micro-C库 (每个约3亿个接触) ，发现从30分钟开始，增强子-启动子接触出现了一个小但高度可重复的下降，在NELFB耗尽60分钟时进一步下降。NELF降解的影响是特异性的增强子-启动子接触，而在转录不活跃的ctcf结合位点上没有观察到。因此，暂停的Pol II有助于促进子-促进子接触水平，NELF降解耗尽增强子-启动子接触。

综上所述，本研究利用高分辨率3C方法，Micro-C、新生RNA测序，以及对Pol II和数千种候选增强子的扰动来研究了转录和增强子-启动子接触动力学之间的相互作用。新的Micro-C数据与CRISPR干扰 (CRISPRi) 实验相结合，测试了近6000个候选增强子，结果显示，功能增强子/启动子对在非常短的3D距离上花费了更多的时间，部分原因是与基因组位置无关的大分子相互作用。转录相关蛋白的操作揭示了Pol II及其转录动力学在建立增强子-启动子接触频率中的关键作用。值得注意的是，暂停的Pol II稳定了增强子-启动子相互作用，表明暂停的Pol II在增强子-启动子通信中起作用。这些观察结果使我们得到了一个更新的模型，该模型包含了转录对增强子-启动子通信的影响。

https://www.nature.com/articles/s41588-023-01442-7