《Bioact. Mater.》厦大李程: 新型眼用粘合剂水凝胶用于治疗干眼症

厦门大学眼科研究所博导李程教授团队在国际生物材料领域顶级期刊《Bioactive Materials》（中科院1区，IF: 18.9）针对干眼症发表题为 “Effectiveness of an ocular adhesive polyhedral oligomeric silsesquioxane hybrid thermo-responsive FK506 hydrogel in a murine model of dry eye ”的原创研究论文。

干眼症是一种常见的眼部疾病，会导致不适和视力受损，影响个人的生活质量。许多用于治疗干眼症的药物在滴眼液中很难溶于水，并且很快从眼表排出，这限制了它们的治疗效果。因此，本研究开发了一种由单功能POSS、PEG和PPG组成的共聚物(MPOSS-PEG-PPG, MPEP)，该共聚物具有温度敏感的溶胶-凝胶转变行为(示意图1)。这种热反应性水凝胶改善了FK506的水溶性，同时提供了黏附性强、长效的眼部给药系统。此外，负载Fk506的POSS水凝胶具有良好的生物相容性，显著提高了与眼表的粘附性。与其他FK506制剂和PEG-PPG-FK506 (F127-FK506)水凝胶相比，该新型MPOSS-PEG-PPG-FK506 (MPEP-FK506)水凝胶治疗小鼠干眼症模型更有效。因此，在POSS水凝胶中递送FK506有可能延长药物在眼表的滞留时间，从而提高其治疗干眼症的疗效。

示意图1 MPEP在水中的自组装和水凝胶形成示意图

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研究背景

干眼症是一种常见的眼部疾病，干眼引起的炎症可导致角膜上皮损伤和神经感觉异常，因此会导致不适和视力受损，影响个人的生活质量。目前许多用于治疗干眼症的药物在滴眼液中很难溶于水如FK506，并且眼内泪液可能会影响药物疗效，减少滴眼液在眼表的停留时间，这限制了它们的治疗效果。充分给药通常需要增加给药频率至每天四到五次，以改善病情的补救;然而，这增加了副作用的风险。因此，想要提高疏水性药物的水溶性，并且能延长其在眼表滞留时间，有必要设计一种新的药物传递系统。

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研究方案

本研究以MPOSS, PEG和PPG嵌段的大二醇为原料合成了一系列聚氨酯基共聚物，这些共聚物具有温度敏感的溶胶-凝胶转变行为。POSS具有较强的疏水性，它的引入将促进两亲性MPEP共聚物在疏水相互作用的驱动下倾向于从单体自组装成胶束，并对胶束化和凝胶化性能产生影响，进一步增加其在生物医学上的应用（图1、2）。含POSS的热响应性水凝胶改善了FK506的水溶性，增加了眼表与水凝胶的黏附，延长了药物滞留时间，改善了干眼的分辨率（图3）。此外，实验结果表明，该水凝胶具有良好的生物相容性，且水凝胶给药不会对眼表健康造成任何风险（图4、5）。

图1 (a) 室温下一系列MPEP浓度下DPH- 1MPEP水溶液的紫外-可见光谱。(b) 外推法测定1MPEP的CMC。(c) MPEP水溶液在500 nm处随温度升高的透光率(2 wt%)。(d) 三种温度下1MPEP水溶液(0.5 wt%)中胶束的尺寸分布。(e) 1MPEP水溶液中粒径与温度和浓度的关系。(f) 70℃水溶液中粒径与MPEP类型和浓度的关系。

图2 (a) 1MPEP和(b) Pluronic F127相图。(c) 温度扫描和(d) 温度渐变过程中1MPEP (6 wt%)的流变性能。

图3 水凝胶的体内评价。(a)裂隙灯和(b)眨眼后眼表水凝胶的OCT图像(红色箭头表示水凝胶在角膜上的位置，绿色箭头表示水凝胶脱离角膜)。(c)眼药代动力学研究。

图4 水凝胶对HCE细胞的体外细胞毒性

图5 结膜的组织学图像。(a) PAS染色显示各组结膜中的杯状细胞(红色箭头表示杯状细胞)。(b) CD4染色显示各组浸润结膜的CD4+ T细胞的数量和位置(红色箭头表示CD4+ T细胞)。定量分析(c) 杯状细胞计数和(d) 结膜内CD4蛋白表达水平。

此外，与商用FK506和PEG-PPG-FK506 (F127-FK506)水凝胶相比，MPOSS-PEG-PPG-FK506 (MPEP-FK506)水凝胶对干眼症的治疗效果更佳。使用不同的滴眼剂来评估携带FK506的水凝胶对小鼠干眼模型的功效。角膜用OGD染料染色，在外层受损的深层区域呈现绿色。从图6a可以看出，OGD染色在模型组、DS5组、PBS处理组、F127处理组、1MPEP处理组和2MPEP处理组中是严重的；然而，市售的FK506、F127-FK506、1M-FK506和2M-FK506组显示出降低的OGD染色，表明这四种制剂对干燥应力引起的角膜上皮缺损具有良好的修复作用。值得注意的是，角膜OGD染色的统计分析显示，2M-FK506的局部应用显著降低了其强度(图6c)。由于对角膜具有更强的粘附性，FK506从该水凝胶中持续缓慢释放保护了角膜上皮细胞免于长时间暴露于泪液缺乏的环境中。泪液产量是评估干眼发展的一个非常重要的临床参数，因为泪液保护角膜上皮细胞不会因眼表水化不充分而丢失。与其他组相比，局部施用2M-FK506显著增加了泪液的产生，但F127-FK506除外，其差异不显著(图6b)。根据这些结果，2M-FK506是一种用于逆转由干眼症引起的泪液分泌不足的有效制剂。MMP-3和MMP-9的表达水平是干眼症引起的角膜屏障功能损伤的关键指标；因此，采用免疫荧光染色来确定它们在角膜上皮中的MMP-3和MMP-9水平(图6d)。局部应用市售FK506、F127-FK506、1M-FK506和2M-FK506可降低角膜上皮中MMP-3的表达和染色。在这些水凝胶中，局部应用2M-FK506最大程度地降低了MMP-3的水平，这表明干燥应激下角膜屏障功能的改善(图6e、f)。

图6 (a) 各组OGD染色图和(c) OGD强度统计图。(b) 使用酚红线试验测量泪液产生。(d) MMP-3免疫荧光染色的代表性图像(红色矩形表示角膜上皮MMP-3免疫荧光染色区域)。量化MMP3染色(e)和表(f)。

干眼症不仅会损害角膜屏障功能，还会使光滑的角膜上皮表面变得粗糙。此外，杯状细胞是简单的柱状上皮细胞，分泌粘蛋白形成泪膜，抵抗眼表环境的变化，但干眼引起的炎症导致杯状细胞损失。2M-FK506水凝胶显著挽救了脱水应力下的杯状细胞损失(图7a、7c)，表明2M-FK506在长时间内抑制了炎症，并在促进由于水凝胶的长期保留而导致的眼表面损伤的恢复中发挥了积极作用。干眼症是一种慢性炎症性免疫疾病，其特征是CD4+T细胞渗入结膜。FK506结合亲免疫素亲环素和FKBP12，抑制钙调神经磷酸酶活性，并指导CD4+T细胞的代谢重编程，以增强其免疫抑制作用。本研究的结果表明，局部应用2M-FK506有效地抑制了DS诱导的CD4+ T细胞在结膜中的浸润(图7b)。考虑到CD4+T细胞在FK506治疗干眼症中起关键作用，CD4的表达被进一步验证。因此，2M-FK506有效地抑制了CD4的表达(图7d)，表明2MPEP允许FK506具有更大的功效。

图7 结膜的组织学图像。(a) PAS染色显示各组结膜中的杯状细胞(红色箭头表示杯状细胞)。(b) CD4染色显示各组浸润结膜的CD4+ T细胞的数量和位置(红色箭头表示CD4+ T细胞)。定量分析(c)杯状细胞计数和(d)结膜内CD4蛋白表达水平。

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研究总结

总之，作者发现用PEG-PPG (F127)共聚物和多面体低聚硅氧烷(POSS)基团修饰的FK506负载眼胶粘剂热响应水凝胶有效地缓解了小鼠的干眼症状。MPEP具有在眼表面自组装的能力，具有合适的胶束化和凝胶化特性。此外，该水凝胶可以负载低水溶性的FK506，并显著增强其眼表潴留。该水凝胶具有良好的体内外生物相容性和低毒性。最后，在小鼠模型中发现，这种POSS热反应性水凝胶比目前可用的药物更有效地抑制干眼症。根据作者研究结果，这种POSS热响应水凝胶在开发长效眼部治疗方法以更有效地治疗眼部疾病方面具有很大的应用前景。