效率可提高百倍！刘如谦团队开发体积更小、效率更高的先导编辑器

先导编辑可以在活细胞中进行多种精确的基因组编辑。

2023年8月31日，博德研究所刘如谦（David R. Liu）团队在Cell在线发表题为“Phage-assisted evolution and protein engineering yield compact, efficient prime editors”的研究论文，该研究使用蛋白质进化和工程技术来生成体积更小、效率更高的先导编辑器。利用噬菌体辅助进化，该研究将紧凑型逆转录酶的编辑效率提高了22倍，并生成了比当前一代编辑器PEmax小516-810个碱基对的先导编辑器。

该研究发现不同的逆转录酶专门从事不同类型的编辑，并利用这一见解产生了优于PEmax和PEmaxΔRNaseH(双AAV递送系统中使用的截断编辑器)的逆转录酶。最后，该研究生成了改善先导编辑的Cas9结构域。这些编辑器(PE6a-g)增强了患者来源的成纤维细胞和原代人T细胞中与治疗相关的编辑。PE6变体还可以在双AAV递送后在体内安装更长的插入，在小鼠大脑皮层中实现40%的loxP插入，与之前最先进的引物编辑器相比，提高了24倍。

先导编辑(PE)几乎可以在活细胞基因组中安装任何替代、小插入或小缺失，而不需要DNA或供体DNA模板中的双链断裂(DSBs)，因此可以纠正绝大多数已知的致病突变。PE需要一个先导编辑指导RNA (pegRNA)和一个先导编辑蛋白，该蛋白由一个可编程的缺口酶和一个逆转录酶(RT)组成。第一代先导编辑器(PE1)使用野生型Moloney小鼠白血病病毒(M-MLV) RT，而随后的先导编辑器(PE2-PE5)使用工程五突变体M-MLV RT。

pegRNA包含一个向导RNA支架，一个指定目标位点的间隔物，一个与目标DNA互补的先导结合位点(PBS)，以及一个编码所需编辑的逆转录酶模板(RTT)。先导编辑器⋅pegRNA复合体与目标基因组DNA的一条链配对，并切割另一条链，生成一个暴露的3 '端，与pegRNA的PBS结合。RTT与由此产生的引物-模板复合物结合，并启动RTT的逆转录。新合成的含有编辑的3 ' DNA瓣被整合到基因组中，取代原始的DNA序列并永久地安装所需的编辑。在PE3和PE5系统中，一个额外的单向导RNA (sgRNA)指导先导编辑器切断未编辑的DNA链，并偏向细胞错配修复，以有利于编辑器的安装。

自PE系统开发以来，通过设计pegRNA、先导编辑器结构和细胞DNA修复反应来改善它们，以获得期望的结果。双先导编辑(twinPE)和相关的“双瓣”方法使用两个pegRNA编辑两条DNA链，从而实现更大的插入和删除(>100个碱基对[bp])。PE和twinPE已被用于安装重组酶着陆点，实现靶向基因大小(> 5000 bp)的插入和反转。

文章模式图（图源自Cell）

尽管取得了这些进展，但事实证明，改进先导编辑蛋白具有挑战性。PE2-PE5系统中使用的M-MLV RT突变是在数十年的改进RT筛选中确定的，随后进行了额外的筛选以优化哺乳动物的PE效率。这些突变对PE的效率至关重要，其他RTs中很少有类似的突变。使用紧凑RT的先导编辑蛋白可以促进体内先导编辑器的递送，不同的RT酶可能支持不同的编辑能力。然而，所有先前报道的使用M-MLV RT以外的RT的先导编辑器，即使经过大量的工程设计，也显示出比PE2低得多的PE效率。在PE2中进一步改进高度工程化的M-MLV RT也被证明是困难的，因为所有报道的这种RT的变体也对哺乳动物细胞PE产生了最小的改善。尽管报道了已知的改善核酸酶性能的Cas9突变也可以提高PE效率，但尚未报道特异性地鉴定出改善PE的Cas9突变。

该研究为PE开发了一种噬菌体辅助连续进化(PACE)选择，并使用进化和蛋白质工程来生成PE6a-g变体，这些变体比以前最先进的先导编辑器更有效和/或更容易在体内传递。PE6变体与其他近期PE进展协同作用，在各种情况下提供累积益处，包括患者来源的成纤维细胞和原代人T细胞。双腺相关病毒(Dual-AAV)递送PE6系统的PE效率比之前最先进的系统提高了12至183倍，在小鼠大脑中安装38至42 bp的编辑，在小鼠皮质的转导细胞中产生62%的loxP序列靶向安装。

参考消息：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)00854-1