最熟悉的陌生人 | 高通量PCR，不一样的PCR（一）

提到PCR，生物相关领域的人对此都不会陌生，但是，什么是高通量PCR？

高通量这个词出现频率最多的领域是高通量测序，今天我们要讨论的高通量PCR技术，从名称就可以看出，这是一项PCR“升级”技术。那么，为什么要尝试PCR的高通量升级？

PCR是公认的简便、快捷、性价比高的基因检测方法

PCR（聚合酶链式反应）技术普及度较高，适合已知基因靶点和对检测效率要求较高的检测，因其“简便、快捷、性价比高”的属性广泛应用于医学检验、法医鉴定、食品安全等领域。在过去的数十年间，PCR已被确立为多种疾病的标准诊断方法，在COVID-19疫情期间，PCR亦被认可为诊断是否感染新冠病毒的“金标准”。

二代与三代的PK：qPCR vs dPCR

在60多年的发展中，基于不同的应用需求，PCR技术已演化出多种类型，从一代的凝胶电泳PCR，到第二代可定量的qPCR（Real-time Quantitative PCR，实时荧光定量PCR），目前已经发展到第三代——可实现DNA分子绝对定量的数字PCR（Digital PCR，简称dPCR）。dPCR的出现引起的投资圈的广泛关注，有多篇行研报告评价dPCR“极有可能引领分子诊断未来10年黄金期的发展”。dPCR具备灵敏度高（实现个位拷贝数检测）、定量准确（DNA分子绝对定量）、高稳定性（可在复杂背景模板的干扰下对罕见的靶标进行检测，且对抑制剂耐受性好）等优势。

在dPCR成为“网红”之前，PCR技术中的佼佼者是qPCR，也是目前应用最广的PCR技术，已有300余款基于qPCR技术的试剂盒获批上市。那么，dPCR解决了qPCR的哪些局限性？

• 定量的问题：qPCR需要做标准曲线，属于相对定量；而dPCR是绝对定量的，可识别差异较小的拷贝数，直接得到样品中目的核酸分子的个数，能很好地诊断需要通过基因变异的拷贝数差异评估疾病严重程度的遗传病，如SMA等。
• 灵敏度的问题：dPCR可以检出突变频率小于0.01%的稀有突变，具有极高的灵敏度，因此dPCR可以使用血液样本进行液体活检，在组织样本受限的情况下更适用。
• 精密度和重复性：dPCR较少受到扩增效率的影响，可有效区分浓度差异（变化）微小的样品，针对临床复杂样本（如病原检测样本）更具有检测稳定性，不易受不同质量样本引入的微量干扰成分的影响，检测准确度更高。

dPCR解决不了的问题：信息通量

dPCR虽然优点显著，但是对于多靶点（target site）的检测却存在着明显的限制。

首先是PCR-base技术的共性问题：非特异性扩增引起的不同靶点扩增互相干扰（一般极限值是20个）、阴性阳性信号分辨率不足等。在尝试增加检测通量时，dPCR通过信号强度区分有极限，通常以区分阴阳性为主，通过设计最多一般只能区分强阳、中阳、弱阳和阴性。此外，由于大多数平台的多重荧光通道只允许每个荧光通路识别一个目标，通过多荧光通道加持实现扩大检测靶点数最多也只能同时进行6-8个靶点的检测，并且会造成检测系统成本的增加。

这样看来，同时检测几十个靶点已经存在困难，要实现“高通量”，即单次检测靶点数达到成百上千级别，dPCR能做到吗？

为什么不能是高通量测序

为什么不是直接用高通量测序？原因是，虽然高通量测序（如二代测序）单次检测可以获得大量信息，在检测未知序列、未知突变、高通量多靶点检测方面是更好的选择，但大量的数据结果对技术人员的数据分析能力有一定的要求，加上检测成本高、建库等操作流程的复杂性，这些都限制了高通量测序技术的应用。

从临床应用角度来看，高通量测序获得的大量意义未明的基因检测信息更适用于科学探索，而对于临床的检测需求，需要结合更多的“确定性”的检测结果为临床诊疗带来明确的提示，而高通量测序的检测结果信息冗余，并不能贴合临床的需求。

相比而言，以PCR原理为核心的检测技术已在临床得到广泛应用。核心原因就在于在靶点特异性检测领域，PCR技术相比测序技术能够减少信息冗余，使得检测结果更为精准更易解读，与临床诊疗决策过程的信息需求更匹配。与此同时，PCR技术相比测序对硬件复杂度的要求显著降低，结果分析更简便，更容易实现自动化，从而对于临床一线检测人员的实际操作更友好。另外，PCR技术有效信息的产出成本更低周期更短，患者获益更显著。因此，基于PCR技术开发诊断产品和解决方案更适合临床诊疗全流程各个环节的需求。

在PCR技术中，dPCR具有更高的性能上限和拓展性，检测性能更高，检测速度更快，同时具有高信息通量潜力。是不是有可能在dPCR的基础上进一步升级，使用新一代技术大幅提高信息通量，从而真正开发出对于临床诊断更完美的检测产品呢？

高通量PCR可以解决dPCR检测通量低的问题

为了解决dPCR信息通量低的问题，普济生物创新研发了“高通量PCR”技术平台，相对于传统PCR技术，高通量PCR在dPCR高灵敏度核酸定量检测的基础上，单管可同时检测上万重靶点。

高通量PCR技术首先在实验流技术上解决了特异性的问题（特殊设计的引物避免非特异性扩增），其次在数据分析上解决了荧光判读的问题（通过6通道荧光编码系统实现多阶信号读取，检测信号提升了两个数量级）。

也就是说，普济生物在dPCR基础上的升级优化，解决了扩增体系和信号分析体系两个层面的多靶点同时检测面临的问题。通过扩增体系底层改进，可以避免非特异性扩增的发生，使得单体系内可同时进行数百上千重PCR系统的同时扩增而互不干扰；通过信号分析体系的系统优化，可以同时分辨多达数万重的靶点扩增信号，两者结合实现了基于PCR技术的高通量检测。

高通量PCR可以实现更快、更便捷的多靶点基因检测，在病原微生物检测（多种病原菌检测和不明感染源检测）、肿瘤诊疗方面（肿瘤早筛、伴随诊断与预后监测）、以及生殖遗传疾病（NIPT与遗传病筛查）等领域具有有比较明显的优势。

综合上面的信息可以看出，依据高通量PCR技术的特点，可以开发出更贴合临床需求的“多快好省”检测产品，辐射更多群体。

• 靶点“多”：高通量检测，单管可同时检测上万重靶点；
• 周期“快”：操作流程简便，最快4小时出结果；
• 性能“好”：灵敏度和准确性高，可以绝对定量；
• 成本“省”：无需复杂硬件和耗材，目标靶点平均检测成本远优于高通量测序技术。

任何一项技术的出现到产品化都有一段时间的积累，相信高通量PCR的技术的发展可以赋能分子检测行业的发展，惠及更多患者。